黃鑫，陳雪，王恩鵬，陳長(zhǎng)寶，劉淑瑩,2※，王文清

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長(zhǎng)春 130117；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所長(zhǎng)春質(zhì)譜中心，長(zhǎng)春 130022；3.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 755258）

疲勞是機(jī)體生理過(guò)程不能維持其機(jī)能在某一特定的水平或者不能維持運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。抗疲勞就是延緩疲勞的產(chǎn)生或者加速疲勞的消除[1]。疲勞的評(píng)價(jià)方法主要有耐力試驗(yàn)和生化指標(biāo)檢測(cè)。測(cè)定機(jī)體持續(xù)運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間可以反映機(jī)體的耐力[2]。機(jī)體生化的改變導(dǎo)致疲勞感覺(jué)發(fā)生，因此，可用與疲勞相關(guān)的生化指標(biāo)來(lái)研究疲勞的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程變化[3,4]。人參為滋補(bǔ)類名貴藥材，具有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智等功效?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，人參具有抗疲勞作用[5-7]。本試驗(yàn)選擇人參、茯苓、蓮子、桂圓等藥、食同源中藥組方，研究其對(duì)血虛小鼠的抗疲勞作用，并探討其抗疲勞的作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠75只，15～20g，雄性，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK-（遼）2015-0001

1.2 藥品與試劑

人參、茯苓、蓮子、桂圓超微粉（吉林省怡生對(duì)外貿(mào)易有限公司，以一定比例混合均勻后備用）；環(huán)磷酰胺（國(guó)藥準(zhǔn)字H32020857，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司）；尿素氮試劑盒（C013-2）、肝糖原試劑盒（A043）、乳酸脫氫酶試劑盒（A020-1）、ATP酶試劑盒（A016-2）、血乳酸試劑盒（A019-1）（南京建成生物工程研究所）；羧甲基纖維素鈉（9004-32-4）（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）。

1.3 儀器

Tecan infinite M200 pro型酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司）；ES-100A型電子天平（沈陽(yáng)龍騰電子儀器公司）；AG 22331高速冷凍離心機(jī)（德國(guó) Eppendorf公司）；Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器（美國(guó)SI公司）；Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）；Bio-Gen PRO 200型精密勻漿機(jī)（美國(guó)PROScientific公司）；電熱恒溫水浴箱（北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠）；超低溫冰箱（美國(guó)熱電公司）；BC2600全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

2 方法

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，按體重隨機(jī)分成5組：正常對(duì)照組、血虛模型組、組方低劑量組1.5g/kg、中劑量組3g/kg、高劑量組6g/kg，每組15只。給藥組按給藥劑量連續(xù)灌胃30d，每天1次；正常對(duì)照組和模型組灌胃給予相等體積的生理鹽水。除正常對(duì)照組外，其余4組第26天開(kāi)始給藥1h后，分別經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg，連續(xù)注射4d；正常對(duì)照組經(jīng)腹腔注射等量的生理鹽水。

2.1 外周血象測(cè)定

于末次給藥后30min，眼眶取血，測(cè)定小鼠紅細(xì)胞總數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)和血紅蛋白含量。

2.2 小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

末次給藥50 min后，鼠尾根部負(fù)荷7%體重的鉛皮，置于游泳箱中游泳（水深25cm，水溫28℃），記錄小鼠自游泳開(kāi)始至死亡的時(shí)間。以小鼠10 s內(nèi)無(wú)法再浮出水面為依據(jù)，來(lái)判斷動(dòng)物死亡。

2.3 小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)

末次給藥50min后開(kāi)始試驗(yàn)，將小鼠放到玻璃棒上，使肌肉處于靜力緊張狀態(tài)，記錄小鼠由于肌肉疲勞從玻璃棒上跌落下來(lái)的時(shí)間，第3次跌落時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，累計(jì)3次的時(shí)間作為爬桿時(shí)間。

2.4 血乳酸含量測(cè)定

末次給藥30min后，在30℃水中不負(fù)重游泳10min后眼球采血20L，休息20min后采血20L，按試劑盒要求測(cè)定血乳酸含量。

2.5 血清尿素氮含量測(cè)定

末次給藥50 min后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將小鼠置于水溫為28℃游泳缸中不負(fù)重游泳60min，休息40min后，摘眼球取血，分離血清，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血尿素氮含量。

2.6 肝糖原含量測(cè)定

末次給藥50 min后，處死小鼠，取肝臟0.05 g，經(jīng)生理鹽水漂洗后濾紙吸干，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肝糖原含量。

2.7 肌肉組織ATP酶活力測(cè)定

負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取后肢肌肉組織，精密稱量0.1g，生理鹽水制成10%勻漿，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肌肉組織Na+K+ATP酶和Ca2+Mg2+ATP酶活力。

2.8 乳酸脫氫酶活力測(cè)定

末次給藥50min后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將置于水溫為28℃游泳缸中不負(fù)重游泳60min，休息40min的小鼠摘眼球取血，分離血清，按測(cè)試盒說(shuō)明書測(cè)定血清乳酸脫氫酶活力。

3 結(jié)果

3.1 人參方對(duì)血虛小鼠血象的影響

由表1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，血虛模型組小鼠白細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞數(shù)目和血紅蛋白含量顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明造血虛模型成功。與血虛模型組相比，人參方低、中、高3個(gè)劑量組紅細(xì)胞和血紅蛋白含量均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），白細(xì)胞有升高趨勢(shì)，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。血象的改變是血虛最明顯的癥狀，人參方能明顯改善血虛小鼠的外周血象。

表1 人參方對(duì)血虛小鼠血象的影響Table 1 The influence of ginseng prescription on hemogram of blood deficiency mice （,n=15）

表1 人參方對(duì)血虛小鼠血象的影響Table 1 The influence of ginseng prescription on hemogram of blood deficiency mice （,n=15）

注：與血虛模型組比較，*.P＜0.05，**.P＜0.01，***.P＜0.001。Note:Compareto blood deficiency model group,*.P＜ 0.05，**.P＜0.01，***.P＜ 0.001.

血紅蛋白含量（g/L）HGB正常對(duì)照組 Normal control group 5.83±1.36 8.01±0.50 131.27±10.10血虛模型組 Blood deficiency model group 2.75±0.74 6.59±1.64 120.80±8.27人參方低劑量組 Ginseng prescription low dose group 2.53±0.71 7.63±0.90 124.20±16.28人參方中劑量組 Ginseng prescription medium dosegroup 2.86±0.84 8.25±0.70** 131.33±13.52*人參方高劑量組 Ginseng prescription high dosegroup 3.35±0.90 8.16±0.79** 134.20±14.91**組別Group白細(xì)胞數(shù)目（ 109/L）WBC紅細(xì)胞數(shù)目（ 1012/L）RBC

3.2 人參方對(duì)血虛小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

與正常對(duì)照組相比，血虛模型組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間顯著縮短（P＜0.01）；與血虛模型組相比，人參方低劑量有延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的趨勢(shì)，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；人參方中、高劑量均能明顯延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間（P＜0.01），見(jiàn)表2。小鼠負(fù)重游泳時(shí)間是衡量運(yùn)動(dòng)耐力時(shí)常選擇的評(píng)價(jià)指標(biāo)，負(fù)重游泳時(shí)間的長(zhǎng)短可以反映小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞的程度。因此，小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間是小鼠肌肉運(yùn)動(dòng)能力的直觀表現(xiàn)，其時(shí)間的長(zhǎng)短代表了小鼠抵抗疲勞能力的大小。

表2 人參方對(duì)血虛小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、爬桿時(shí)間和全血乳酸含量的影響Table 2 The influence of ginseng prescription on load swimming time,climbing pole timeand blood lactic acid content of blood deficiency mice （）

表2 人參方對(duì)血虛小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、爬桿時(shí)間和全血乳酸含量的影響Table 2 The influence of ginseng prescription on load swimming time,climbing pole timeand blood lactic acid content of blood deficiency mice （）

游泳后休息20 min Rest 20 min after swimming正常對(duì)照組Normal control group 515.20±137.28 579.47±186.03 5.70±1.61 5.78±1.57組別Group負(fù)重游泳時(shí)間（min）Load swimming time爬桿時(shí)間（min）Climbing poletime全血乳酸含量（mmol/L）Blood lactic acid content游泳10 min后After swimming 10 min血虛模型組Blood deficiency model group 332.20±105.66 251.60±73.14 7.35±2.20 7.75±2.34人參方低劑量組Ginseng prescription low dosegroup 358.60±100.80 312.20±99.10 5.37±1.32* 6.62±1.96人參方中劑量組Ginseng prescription medium dose group 511.47±160.91* 460.07±131.97*** 4.49±1.38*** 5.65±1.77**人參方高劑量組Ginseng prescription high dose group 521.87±161.72*** 511.20±158.01*** 4.10±1.18*** 4.41±1.14***

3.3 人參方對(duì)血虛小鼠爬桿時(shí)間的影響

與正常對(duì)照組相比，血虛模型組小鼠爬桿時(shí)間顯著縮短（P＜0.01）；與血虛模型組相比，人參方低劑量有延長(zhǎng)小鼠爬桿時(shí)間的趨勢(shì)，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；人參方中、高劑量均能顯著延長(zhǎng)小鼠爬桿時(shí)間（P＜0.01），見(jiàn)表2。小鼠爬桿時(shí)間是衡量運(yùn)動(dòng)耐力時(shí)另一個(gè)經(jīng)常選擇的評(píng)價(jià)指標(biāo)，累計(jì)爬桿時(shí)間的長(zhǎng)短可以反應(yīng)小鼠靜用力時(shí)疲勞的程度。因此，累計(jì)爬桿時(shí)間是小鼠肌肉運(yùn)動(dòng)能力的直觀表現(xiàn)，其時(shí)間的長(zhǎng)短代表了小鼠抵抗疲勞能力的大小。

3.4 人參方對(duì)血虛小鼠全血乳酸含量的影響

小鼠游泳10 min后全血乳酸含量試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，與正常對(duì)照組相比，血虛模型組小鼠全血乳酸含量顯著升高（P＜0.05）；與血虛模型組相比，組方低、中、高劑量均能顯著降低小鼠全血乳酸含量（P＜0.05或P＜0.001）。小鼠游泳后休息20 min測(cè)全血乳酸含量，試驗(yàn)結(jié)果與正常對(duì)照組相比，血虛模型組小鼠全血乳酸含量顯著升高（P＜0.05）；與血虛模型組相比，人參方低劑量有降低小鼠全血乳酸含量的趨勢(shì)，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；人參方中、高劑量能顯著降低小鼠全血乳酸含量（P＜0.05或P＜0.01）。降低血乳酸水平是提高機(jī)體抗疲勞能力的途徑。因此，減少血乳酸的產(chǎn)生，可延緩疲勞的發(fā)生。本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果游泳10 min后和休息20 min后的全血乳酸含量顯著降低，表明人參方可提高小鼠的有氧代謝能力，使糖酵解過(guò)程中產(chǎn)生的乳酸不容易在肌肉組織蓄積，從而達(dá)到抵抗疲勞產(chǎn)生的效果。

3.5 人參方對(duì)血虛小鼠血清尿素氮含量的影響

與正常對(duì)照組相比，血虛模型組小鼠血清尿素氮含量顯著升高（P＜0.01）；與血虛模型組相比，人參方低、中、高劑量均能降低小鼠血清尿素氮含量（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)表3。機(jī)體血清尿素氮含量隨運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增加而增加，隨著血清尿素氮的增加，機(jī)體對(duì)負(fù)荷的適應(yīng)能力差，顯示疲勞的現(xiàn)象。因此，血清尿素氮與機(jī)體運(yùn)動(dòng)適應(yīng)能力、疲勞程度以及負(fù)荷量的大小密切相關(guān)[8]，可作為評(píng)定疲勞程度的指標(biāo)。

表3 人參方對(duì)血虛小鼠血清尿素氮含量、肝糖原含量、肌肉組織ATP酶活力和乳酸脫氫酶活力的影響Table 3 Theinfluence of ginseng prescription on serum urea nitrogen content,hepatic glycongen content,ATPenzyme activity in muscle tissue and activity of serum lactate dehydrogenase of blood deficiency mice （）

表3 人參方對(duì)血虛小鼠血清尿素氮含量、肝糖原含量、肌肉組織ATP酶活力和乳酸脫氫酶活力的影響Table 3 Theinfluence of ginseng prescription on serum urea nitrogen content,hepatic glycongen content,ATPenzyme activity in muscle tissue and activity of serum lactate dehydrogenase of blood deficiency mice （）

組別Group血清尿素氮含量（mmol/L）Serum urea nitrogen content肝糖原含量（mg/g）Hepatic glycongen content Ca2+Mg2+ATP酶活力（μmol/mg）Ca2+Mg2+ATP enzyme activity Na+K+ATP酶活力（μmol/mg）Na+K+ATP enzymeactivity血乳酸脫氫酶活力（U/L）Serum lactate dehydrogenaseactivity正常對(duì)照組Normal control group 10.18±3.14 5.95±1.47 4.32±0.88 3.96±0.53 4 912.22±450.12血虛模型組Blood deficiency model group 13.40±1.98 6.28±1.43 3.57±0.37 3.36±0.46 4 767.91±612.62人參方低劑量組Ginseng prescriptionlow dosegroup人參方中劑量組Ginseng prescription medium dosegroup人參方高劑量組Ginseng prescriptionhigh dose group 10.74±3.10** 5.61±1.04 3.59±1.18 3.31±0.79 4 802.68±888.39 10.53±2.90** 7.64±2.24 4.54±1.34* 4.14±0.99* 5 497.86±708.76**9.58±2.80*** 6.37±1.98 4.66±1.17** 4.55±1.23** 5 608.70±894.42**

3.6 人參方對(duì)血虛小鼠肝糖原含量的影響

與正常對(duì)照組相比，血虛模型組小鼠肝糖原含量無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與血虛模型組相比，組方低、中、高劑量對(duì)小鼠肝糖原含量均無(wú)明顯影響（P＞0.05），見(jiàn)表3。肝糖原的儲(chǔ)備量可直接影響機(jī)體體能和運(yùn)動(dòng)性疲勞出現(xiàn)的快慢或程度，提高肝糖原的儲(chǔ)備量或減少其消耗，有助于提高機(jī)體耐力和運(yùn)動(dòng)能力，有利于抵抗疲勞的產(chǎn)生[9]。

3.7 人參方對(duì)血虛小鼠肌肉組織ATP酶活力的影響

與正常對(duì)照組相比，血虛模型組小鼠Ca2+Mg2+ATP酶和Na+K+ATP酶活力顯著降低（P＜0.01）；與血虛模型組相比，人參方低劑量組對(duì)小鼠 Ca2+Mg2+ATP酶和Na+K+ATP酶活力有增加趨勢(shì)，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；人參方中、高劑量組小鼠Ca2+Mg2+ATP酶和Na+K+ATP酶活力均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)表3。Ca2+Mg2+ATP酶活力有增加趨勢(shì)，提示能夠改善運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼肌的功能，有利于提高骨骼肌的收縮力和收縮速度，抵抗疲勞的產(chǎn)生[10]。增加Na+K+ATP酶的活力，提示人參方能夠改善運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼肌的功能，有利于提高骨骼肌的收縮力和收縮速度，抵抗疲勞的產(chǎn)生。

3.8 人參方對(duì)血虛小鼠乳酸脫氫酶活力的影響

與正常對(duì)照組相比，血虛模型組小鼠血清乳酸脫氫酶活力有降低趨勢(shì)，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與血虛模型組相比，人參方低劑量組小鼠血清乳酸脫氫酶活力有升高趨勢(shì)，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；人參方中、高劑量組小鼠血清乳酸脫氫酶活力顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)表3。乳酸脫氫酶活力大小直接影響著乳酸的清除速度，通過(guò)提高乳酸脫氫酶活力來(lái)降低血乳酸水平也是提高機(jī)體抗疲勞能力的途徑[11]。

4 結(jié)論與討論

抗疲勞驗(yàn)證試驗(yàn)檢測(cè)的指標(biāo)中，白細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白、小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、爬桿時(shí)間、全血乳酸含量、血清尿素氮含量、Ca2+Mg2+ATP酶活力和Na+K+ATP酶活力含量9個(gè)指標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，血虛模型組與正常對(duì)照組相比，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01），說(shuō)明血虛模型小鼠耐疲勞能力明顯下降，表明造模成功[12-14]。

與血虛模型組相比，人參方中、高劑量均能明顯延長(zhǎng)血虛小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和爬桿時(shí)間，升高 Ca2+Mg2+ATP酶活力和Na+K+ATP酶活力，升高乳酸脫氫酶活力；人參方低、中、高劑量均能降低血虛小鼠血清尿素氮含量，降低全血乳酸含量，表明在中、高劑量或低、中、高劑量下，人參方可以提高血虛小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，降低靜用力時(shí)疲勞，提高有氧代謝能力，改善運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼肌的功能[15-16]。但組方低、中、高劑量均對(duì)小鼠肝糖原含量無(wú)明顯影響，可見(jiàn)并沒(méi)有明顯提高肝糖原的儲(chǔ)備量或減少其消耗。

綜上，按照中華人民共和國(guó)保健食品檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范中緩解體力疲勞功能評(píng)價(jià)判定規(guī)則，負(fù)重游泳時(shí)間和爬桿時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性、血清尿素氮和全血乳酸含量試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，可判定該人參方對(duì)于血虛小鼠具有緩解體力疲勞功能的作用，可按照保健食品研究開(kāi)發(fā)[17-20]。其機(jī)制可能是通過(guò)降低血清尿素氮水平，增強(qiáng)了機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)能力；提高血清乳酸脫氫酶活力，降低血乳酸的生成，從而延緩機(jī)體疲勞的產(chǎn)生；提高肌肉組織ATP酶活力，提高骨骼肌的收縮力和收縮速度，改善運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼肌的功能，抵抗疲勞的產(chǎn)生。