李雪雪 郭雯巖 周璇 趙偉 牛鐵泉 紀(jì)薇

摘要：為提高鮮食葡萄苗木品質(zhì)和良種繁育速度，以鮮食葡萄品種晶紅寶為試驗(yàn)材料，探究培養(yǎng)基天然營(yíng)養(yǎng)添加物的種類及濃度、外植體消毒時(shí)間、光周期、微嫁接方法和綁縛材料等因素對(duì)葡萄微嫁接苗成活率的影響，結(jié)合響應(yīng)面法確定葡萄微嫁接苗組培最佳試驗(yàn)條件，優(yōu)化葡萄微嫁接組培快繁體系。結(jié)果表明，MS+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂培養(yǎng)基（pH 5.8～6.0）中添加香蕉泥可顯著降低微嫁接苗的褐變率和污染率，促進(jìn)不定根的伸長(zhǎng)。響應(yīng)面分析進(jìn)一步確定了葡萄微嫁接組培的最佳試驗(yàn)條件為氯化汞消毒7.1 min，光照17 h，香蕉泥濃度700 mg/L。在此基礎(chǔ)上采用劈接法、錫箔紙作綁縛材料的葡萄微嫁接苗成活率顯著高于其他處理。

關(guān)鍵詞：葡萄;組織培養(yǎng);微嫁接;響應(yīng)面分析

中圖分類號(hào)：S663.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）09-0069-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.016? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： In order to improve the quality of fresh grape seedlings and the breeding speed of fresh varieties， the fresh grape variety Jinghongbao was used as the experimental material to explore the effects of factors such as the type and concentration of natural nutrient additives， disinfection time of explants， photoperiod， micro-grafting methods and binding materials on the survival rate of grape micro-grafted seedlings. The best experimental conditions for grape micro-grafted seedlings were determined by response surface methodology， and the grape micro-grafting tissue culture rapid propagation system was optimized. The results showed that the addition of banana mud in MS+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30.0 g/L sucrose+7.0 g/L agar medium（pH 5.8～6.0） could significantly decrease the browning rate and pollution rate of micro-grafted seedlings and promote the elongation of adventitious roots. The response surface analysis further confirmed that the optimal experimental conditions for grape micro-grafting tissue culture were： HgCl2 disinfection time 7.1 min， light time 17 h， banana mud concentration 700 mg/L. On this basis， the survival rate of grape micro-grafted seedlings using the splicing method and tin foil as the binding material was significantly higher than other treatments.

Key words： grape; tissue culture; micrografting; response surface analysis

中國(guó)是葡萄（Vitis spp.）生產(chǎn)大國(guó)，截至2018年底葡萄產(chǎn)量已達(dá)845.0萬t[1]。中國(guó)葡萄生產(chǎn)以鮮食葡萄為主，品種單一和苗木質(zhì)量參差不齊是限制中國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要原因，優(yōu)質(zhì)高效標(biāo)準(zhǔn)化栽培模式及管理技術(shù)對(duì)于葡萄現(xiàn)代化產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義[2]。葡萄微嫁接技術(shù)是葡萄組織培養(yǎng)與嫁接繁殖技術(shù)的結(jié)合，具有周期短、效率高、不受季節(jié)限制和環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)[3]，自1972年Murashige等創(chuàng)立微芽嫁接技術(shù)以來，微嫁接技術(shù)已廣泛應(yīng)用于研究良種保存、植物檢疫、砧穗親和性、信號(hào)傳導(dǎo)以及離體繁殖等領(lǐng)域[4]。因此，建立有效的鮮食葡萄微嫁接苗組培快繁體系是修復(fù)葡萄組織培養(yǎng)畸形發(fā)育及繁殖無毒苗木的基礎(chǔ)。

常規(guī)的組培快繁體系包括外植體的接種、初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)等環(huán)節(jié)，微嫁接組培快繁體系在此基礎(chǔ)上還涵蓋微嫁接苗的建立及培養(yǎng)等技術(shù)。葡萄微嫁接苗的成活率受多種因素影響[5]，單獨(dú)利用某種因素優(yōu)化組培快繁體系較為片面。響應(yīng)面（Box-Behnken design，BBD）法可在各環(huán)節(jié)單因素預(yù)試驗(yàn)條件包括最佳設(shè)計(jì)的前提下，通過對(duì)自變量和組培苗成活率的關(guān)系建立模型并進(jìn)行綜合分析，得到可靠的試驗(yàn)因素優(yōu)化方案[6]。

本試驗(yàn)以鮮食葡萄品種晶紅寶為試驗(yàn)材料，采用響應(yīng)面法研究無菌外植體的消毒、組培光周期和培養(yǎng)基的成分及配比對(duì)葡萄微嫁接苗成活率的影響，結(jié)合適宜的微嫁接方法和最佳綁縛材料，建立并優(yōu)化適用于葡萄微嫁接的組培快繁體系，為有關(guān)葡萄微嫁接的研究提供了良好的試驗(yàn)系統(tǒng)，同時(shí)也為鮮食葡萄良種保存和苗木繁育提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

于2017年7月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站（37°25′21″ N，112°34′45″ E，803 m）采集晶紅寶嫩梢作為優(yōu)化葡萄微嫁接快繁體系的試驗(yàn)材料。試材采用籬架式種植，栽植密度為1.0 m×1.6 m，常規(guī)管理。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 外植體的消毒與培養(yǎng)? 清晨露水未干時(shí)剪取健康的葡萄幼嫩莖段，流水沖洗2 h去除灰塵和蟲卵，剪成約5 cm的莖段作為外植體，在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面消毒。具體消毒方法為：75%的乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗2～3次，0.1%的氯化汞浸泡后，無菌水沖洗5次。試驗(yàn)設(shè)計(jì)0.1%的氯化汞處理時(shí)間分別為6、8和10 min，處理后的莖段用滅菌的濾紙吸去表面水分備用。

將消毒后的材料截成約2 cm的單芽莖段，切去兩端切口部位，接種于MS+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂培養(yǎng)基（pH 5.8～6.0）上，置于組培室培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境溫度為（25±1） ℃，光照度為2 000 lx，光周期16 h/8 h（光/暗），10 d后觀察記錄葡萄組培苗的生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)成活率、褐變率和污染率。

1.2.2? 葡萄組培苗的微嫁接? 葡萄外植體培養(yǎng)6周后剪取單芽莖段，采用3種不同方法進(jìn)行微嫁接，7 d后觀察統(tǒng)計(jì)成活率、褐變率及污染率。具體微嫁接方法如下。

1）劈接法。砧木切除芽節(jié)上的腋芽及葉片，上端縱切0.4 cm，接穗形態(tài)學(xué)基端縱切0.5 cm長(zhǎng)的楔形，直接插入砧木的接口中，嫁接部位緊密不偏，包裹好接口處，接入培養(yǎng)基中。

2）圓孔接法。使用解剖針在砧木頂端切口扎深0.4 cm的圓孔，接穗基端削尖插入圓孔，接合緊密，接入培養(yǎng)基中。

3）“L”形接法。在砧木頂端向下縱切0.4 cm，截去一側(cè)組織使頂端呈“L”形，接穗切成倒“L”形，將砧木和接穗的切口契合，接口包裹緊密，接入培養(yǎng)基中。

采用上述試驗(yàn)中最適宜的方法進(jìn)行葡萄的微嫁接，選取錫箔紙、嫁接夾、Parafilm膜、吸管和鋁片5種綁縛材料對(duì)微嫁接苗接口進(jìn)行綁縛，7 d后觀察統(tǒng)計(jì)成活率、褐變率及污染率。

1.2.3? MS培養(yǎng)基添加天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)葡萄微嫁接苗? 將葡萄微嫁接苗接種在添加500 mg/L不同天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（香蕉泥、棗泥、馬鈴薯泥、番茄泥、椰粉）的MS+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂培養(yǎng)基（pH 5.8～6.0）上，香蕉泥、棗泥、馬鈴薯泥與番茄泥均常溫研磨，椰粉為常溫沖泡，以不添加天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基作空白對(duì)照。記錄各處理下微嫁接苗的成活情況、生根情況和葉片數(shù)。

選取上述處理中微嫁接苗成活率最高的天然營(yíng)養(yǎng)添加物，進(jìn)一步設(shè)置濃度分別為250、500、750、1 000 mg/L的處理，觀察統(tǒng)計(jì)微嫁接苗相關(guān)數(shù)據(jù)，探究培養(yǎng)基中添加該天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的最適濃度。

1.2.4? 不同光周期環(huán)境培養(yǎng)葡萄微嫁接苗? 設(shè)置不同的葡萄微嫁接苗培養(yǎng)光周期，分別為8 h/16 h、 14 h/10 h、16 h/8 h和24 h/0 h（光/暗），10 d后觀察統(tǒng)計(jì)微嫁接苗的成活率、褐變率和污染率。

1.2.5? 響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄微嫁接組培快繁技術(shù)? 在前期單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取氯化汞消毒時(shí)間（A）、光照時(shí)間（B）和天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度（C）3個(gè)因素為響應(yīng)曲面模型的自變量，每個(gè)自變量設(shè)置3個(gè)水平，分別編碼為-1、0和1，以葡萄微嫁接苗的成活率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)見表1。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)處理，設(shè)3組生物學(xué)重復(fù)。利用Excel 2013和SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)分析響應(yīng)曲面模型。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 氯化汞消毒時(shí)間對(duì)葡萄微嫁接苗生長(zhǎng)的影響

由表2可知，氯化汞消毒時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)葡萄組培苗的成活率、褐變率和污染率均有顯著影響。經(jīng)氯化汞處理8 min的葡萄微嫁接苗成活率顯著高于其他2個(gè)處理，褐變率顯著低于其他2個(gè)處理。長(zhǎng)時(shí)間的氯化汞消毒可顯著降低葡萄微嫁接苗的污染率，同時(shí)由于消毒劑對(duì)植物的影響，外植體褐變率顯著升高。綜合比較得出，氯化汞處理8 min消毒效果較好。

2.2? 微嫁接方法對(duì)葡萄微嫁接苗生長(zhǎng)的影響

不同微嫁接方法對(duì)葡萄微嫁接苗生長(zhǎng)的影響差異顯著（圖1）。采用劈接法的葡萄微嫁接苗成活率顯著高于“L”形接法和圓孔法，褐變率和污染率顯著低于“L”形接法和圓孔法。因此，劈接法為葡萄微嫁接的最佳方法。

2.3? 綁縛材料對(duì)葡萄微嫁接苗生長(zhǎng)的影響

不同綁縛材料對(duì)葡萄微嫁接苗生長(zhǎng)的影響如圖2所示。使用錫箔紙作為綁縛材料的微嫁接苗成活率顯著高于嫁接夾、Parafilm膜、吸管和鋁片處理，而褐變率顯著低于嫁接夾、吸管和鋁片處理;使用吸管作為綁縛材料的微嫁接苗成活率顯著低于其他處理（Parafilm膜除外），褐變率顯著高于其他處理;使用Parafilm膜作綁縛材料則導(dǎo)致葡萄微嫁接苗的污染率顯著增加。綜上可見，錫箔紙是葡萄微嫁接的最佳綁縛材料。

2.4? 天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)葡萄微嫁接苗生長(zhǎng)的影響

在MS培養(yǎng)基中添加不同天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，葡萄微嫁接苗的生長(zhǎng)情況也存在顯著差異（表3）。與不添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中微嫁接苗（空白對(duì)照）相比，添加香蕉泥可顯著降低葡萄微嫁接苗的褐變率和污染率，提高平均根數(shù)和根長(zhǎng)，但微嫁接苗成活率和葉片數(shù)無顯著變化;添加棗泥可顯著降低葡萄微嫁接苗的污染率，促進(jìn)不定根的伸長(zhǎng);添加馬鈴薯泥培養(yǎng)的微嫁接苗成活率無顯著變化，但褐變率和平均根長(zhǎng)顯著降低，污染率顯著高于空白對(duì)照;添加番茄泥培養(yǎng)的微嫁接苗污染率顯著高于空白對(duì)照，平均根長(zhǎng)顯著低于對(duì)照;添加椰粉后微嫁接苗的褐變率顯著高于空白對(duì)照，其他指標(biāo)無顯著變化。結(jié)果表明，MS+香蕉泥最適用于葡萄微嫁接組織培養(yǎng)，可有效提高微嫁接苗成活率，促進(jìn)植株生長(zhǎng)。

進(jìn)一步對(duì)添加香蕉泥的濃度進(jìn)行探究得出，添加500和750 mg/L香蕉泥可顯著提高葡萄微嫁接苗的成活率和不定根的數(shù)量及長(zhǎng)度，而添加500 mg/L香蕉泥培養(yǎng)的微嫁接苗褐變率顯著低于其他處理（表4）。因此，MS+500 mg/L香蕉泥為葡萄微嫁接組培快繁體系最佳培養(yǎng)基。

2.5? 光周期對(duì)葡萄微嫁接苗生長(zhǎng)的影響

不同光周期對(duì)葡萄微嫁接苗生長(zhǎng)情況的影響存在顯著差異（表5）。16 h/8 h光照時(shí)葡萄微嫁接苗成活率為50.5%，顯著高于其他光周期處理，同時(shí)褐變率顯著低于其他光周期處理。24 h/0 h光照環(huán)境顯著降低了葡萄微嫁接苗的成活率，但污染率顯著高于其他處理，其他處理的污染率之間差異不顯著。因此，適度的暗處理對(duì)葡萄微嫁接苗的生長(zhǎng)發(fā)育是十分必要的，16 h/8 h光照環(huán)境可保證較高的成活率，適用于葡萄微嫁接苗的組織培養(yǎng)。

2.6? 響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄微嫁接組培快繁體系

2.6.1? 回歸方程擬合與響應(yīng)面分析? 選擇氯化汞消毒時(shí)間、光照時(shí)間和香蕉泥濃度作為響應(yīng)面試驗(yàn)的自變量，按照三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，得出試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表6所示。利用Design-Expert軟件擬合試驗(yàn)結(jié)果得出響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程Y=62.60-9.82A+1.95B+8.23C-0.75AB+0.30AC+1.25BC-10.95A2-12.20B2-10.45C2。

由表7可知，模型的P值=0.000 1<0.01，表明模型與3個(gè)自變量的線性關(guān)系極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.301 0>0.05，且回歸方程R2=0.970 9，表明該方程擬合良好，結(jié)果可靠。3個(gè)自變量對(duì)葡萄微嫁接苗成活率的影響排序?yàn)槁然緯r(shí)間>香蕉泥濃度>光照時(shí)間。

如圖3所示，表示不同試驗(yàn)因素間交互作用的等高線形狀越接近橢圓形，因素之間的交互作用越顯著，越接近圓形則交互作用顯著性越低[7]。由圖3可以看出，光照時(shí)間和香蕉泥濃度的交互作用明顯，在三維立體圖中出現(xiàn)最高值，且該值出現(xiàn)在較長(zhǎng)的光照時(shí)間（16～20 h）和較高的香蕉泥濃度（500～750 mg/L）范圍內(nèi)。

2.6.2? 模型最優(yōu)試驗(yàn)條件的推斷及驗(yàn)證? 通過對(duì)響應(yīng)面曲線和回歸方程的分析，得到葡萄微嫁接苗成活率最高的試驗(yàn)條件為：氯化汞消毒時(shí)間7.11 min，光照時(shí)間16.92 h，香蕉泥濃度697.09 mg/L，在此條件下葡萄微嫁接苗成活率預(yù)測(cè)值為66.527 6%。

在最佳試驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上設(shè)置氯化汞消毒時(shí)間7.1 min，光照時(shí)間17 h，香蕉泥濃度700 mg/L進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到葡萄微嫁接苗的成活率為（65.2±0.8）%，與預(yù)測(cè)值無顯著差異，證明響應(yīng)面法可有效優(yōu)化葡萄微嫁接組培快繁技術(shù)體系。

3? 討論

外植體的表面消毒是葡萄組培快繁的第一步，外植體消毒試劑種類較多，實(shí)際應(yīng)用中常為追求更好的消毒效果而忽略消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響，易造成消毒時(shí)間過長(zhǎng)，毒害植物，降低外植體成活率[8，9]。氯化汞消毒耗時(shí)短，本試驗(yàn)采用0.1%的氯化汞溶液浸泡外植體，不僅對(duì)于降低葡萄外植體的污染效果顯著，還可避免高濃度試劑的高毒性對(duì)試驗(yàn)人員造成傷害。

培養(yǎng)基的成分配比和培養(yǎng)環(huán)境對(duì)葡萄微嫁接苗增殖和生根影響顯著[10，11]。方中明等[12]通過探究天然添加物對(duì)鐵皮石斛類原球莖增殖、分化及生根的影響，確定香蕉汁和馬鈴薯汁均有利于鐵皮石斛小苗生根。葡萄的組織培養(yǎng)中也常用天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為植株生長(zhǎng)提供所需要的氨基酸和微量元素，促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)[13]，但具體種類與比例的選擇尚無統(tǒng)一有效的方案。本試驗(yàn)中，接種于添加500 mg/L香蕉泥的MS培養(yǎng)基中的葡萄微嫁接苗成活情況顯著優(yōu)于其他處理，證明香蕉泥是葡萄組織培養(yǎng)的理想天然營(yíng)養(yǎng)添加物。

微嫁接的具體操作是葡萄微嫁接組培快繁體系的重要環(huán)節(jié)[14]。目前常用的嫁接方法有劈接法、皮接法、“L”型接法和圓孔接法等，部分方法對(duì)接穗和砧木的莖粗有較高要求，操作困難且適用性有限[15];微嫁接苗砧穗接口的綁縛材料多選用移液槍頭和硅膠管，這類材料操作便利，可以及時(shí)觀察接口的愈合程度，Parafilm膜和嫁接夾成本高，且具有透光、導(dǎo)熱和熔點(diǎn)低，難以高溫滅菌等缺點(diǎn)，難以適應(yīng)不同粗細(xì)微嫁接苗的綁縛要求，增加操作難度和污染風(fēng)險(xiǎn)[16]。本試驗(yàn)最終采用劈接法，并選用錫箔紙作綁縛材料，顯著提高了葡萄微嫁接苗的成活率，進(jìn)一步完善了葡萄微嫁接組培快繁技術(shù)體系。

響應(yīng)面法是一種引入數(shù)理統(tǒng)計(jì)在內(nèi)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化方法，通過編碼自變量水平設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案，并得出試驗(yàn)結(jié)果與所有自變量的回歸方程[17]。響應(yīng)面法建立的預(yù)測(cè)模型考慮到單個(gè)自變量影響的同時(shí)，還通過對(duì)模型適應(yīng)性和顯著性的檢驗(yàn)分析，利用等高線圖和3D圖體現(xiàn)出自變量之間的交互作用[18]。本試驗(yàn)探究了外植體表面消毒時(shí)間、培養(yǎng)基天然營(yíng)養(yǎng)添加物的種類和濃度及組培光周期對(duì)葡萄微嫁接苗成活情況的影響，采用響應(yīng)面法進(jìn)行分析，并結(jié)合微嫁接方法和綁縛材料的選擇，得到葡萄微嫁接苗組織培養(yǎng)的最佳試驗(yàn)條件，建立了葡萄微嫁接組培快繁體系，為改善鮮食葡萄的苗木品質(zhì)和繁育技術(shù)提供理論依據(jù)。

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收稿日期：2019-03-04

基金項(xiàng)目：山西省科技重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（201703D221014-4）;山西省青年拔尖人才計(jì)劃項(xiàng)目（2018）;山西省高等學(xué)校優(yōu)秀青年學(xué)術(shù)帶頭人項(xiàng)目（2017）;山西農(nóng)業(yè)大學(xué)青年拔尖創(chuàng)新人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（TYIT201401）

作者簡(jiǎn)介：李雪雪（1994-），女，山西臨汾人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槠咸盐⒓藿蛹夹g(shù)，（電話）18234498356（電子信箱）lishirley1994@163.com;通信作者，牛鐵泉（1964-），男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，博士，主要從事葡萄栽培與種質(zhì)資源創(chuàng)新研究，（電子信箱）niutiequan@126.com;紀(jì)? 薇（1983-），女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，博士，主要從事葡萄栽培與種質(zhì)資源創(chuàng)新研究，（電子信箱）jiweiputao@163.com。