郭鍇騰，李景艷，路 靜，劉培慶

(中山大學藥學院，廣東 廣州 510006)

病理性心肌肥大是心臟在面對多種病理性刺激所發(fā)生的代償性反應，初始心臟特征為心室腔變小、心室壁變厚。在細胞層面，其主要表現(xiàn)為心肌細胞表面積增大，蛋白如心鈉素(atrial natriuretic factor，ANF)、腦鈉肽(brain natriuretic polypeptide，BNP)、β肌球蛋白重鏈(beta-myosin heavy chain，β-MHC)的表達增多，隨著疾病進程的發(fā)展，最終導致單個心肌細胞的延長而變薄，心室壁擴張且變薄，造成收縮功能障礙和心力衰竭[1]。但其具體病理機制仍有待進一步闡明。

活化T細胞核轉錄因子家族(nuclear factor of activated T cells，NFATs)在細胞信號轉導中扮演著重要的角色，能夠在胞質、胞核中穿梭，發(fā)揮調節(jié)轉錄功能。研究表明，該家族的NFATc3和NFATc4亞型與心臟功能密切相關，在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[2]。本實驗室前期研究證明，NFATc3和NFATc4在心肌肥大的病理過程中被激活[3-4]，而去磷酸化激活后的NFATc4結合到BNP的啟動子上，促進肥大基因BNP的表達[5]。

多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(poly-ADP-ribose polymerase 1，PARP1)是真核細胞內具有多聚腺苷二磷酸核糖及聚合酶活性的蛋白家族的首要亞型，其活性至少占據(jù)該家族的85%。PARP1能夠被受損的DNA激活，催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)分解為ADP核糖以及煙酰胺，然后以ADP核糖為底物，使受體蛋白及自身發(fā)生多聚腺苷酸二磷酸核糖(polymers of ADP-ribose，PAR)化修飾，進而發(fā)揮修復DNA的作用[6]。但近年來，多項研究表明PARP1與心臟關系密切。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，PARP1可以影響多個蛋白的出入核來影響心肌肥大。PARP1可通過修飾STAT3使其保持在核內，加劇心肌肥大[7]，也可通過促進高遷移率蛋白B1的出核，進而促進心肌肥大的發(fā)生[8]。還可以通過影響叉頭轉錄因子O3(forkhead box O3，F(xiàn)oxO3)的翻譯后修飾水平，促進其出核轉運，抑制其轉錄活性，進而誘導心肌肥大的發(fā)生[9]。基于此，本研究旨在探究在病理性心肌肥大疾病模型下，PARP1與NFATc3、NFATc4的關系，為闡明病理性心肌肥大機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與實驗動物 本實驗所采用的細胞均為從出生1～3 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠分離得的原代心肌細胞。SPF級SD大鼠，♂，體質量(200 ± 20)g，購自于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，動物質量合格編號：NO.44007200055692，用于構建異丙腎上腺素(isoprenaline，ISO)誘導的心肌肥大模型。SD大鼠乳鼠，購自于中山大學動物實驗中心，動物質量合格編號：No.44008500017332。

1.1.2試劑 磷酸鹽緩沖液(PBS，武漢博士德公司)；胎牛血清(美國Gibco)；胰酶、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxy-uridine，BrdU)、DAPI(美國Sigma)；TRIzol(日本Takara)；RNA逆轉錄試劑盒、SYBR Premix EX Taq、BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo)；NFATc3抗體、NFATc4抗體(美國Santa Cruz)；PARP1抗體、Lamin B1抗體(美國CST)；α-tubulin抗體(美國Sigma)；PAR抗體(美國Trevigen)；熒光二抗(美國PTG)；ISO粉末(日本TCI)；羅丹明鬼筆環(huán)肽、Lipofectamine 2000、Opti-MEM培養(yǎng)基(美國Invitrogen)；核蛋白抽提試劑盒(美國Active Motiff)；3AB(美國MCE)。

1.1.3儀器 超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；CO2培養(yǎng)箱、ArrayScanVTI全自動細胞組高內涵篩選分析系統(tǒng)、熒光定量PCR儀(美國Thermo)；XD5-1B倒置顯微鏡(德國Leica)；FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡(日本奧林巴斯)；冷凍臺式高速離心機(德國Eppendorf)；蛋白電泳、電轉儀(美國Bio-Rad)；LAS4000化學發(fā)光成像儀(美國Waukesha)。

1.2 方法

1.2.1主要試劑配制 ISO溶液(細胞用)配制濃度為10 mmol·L-1；ISO溶液(動物用)配制濃度為12.5 g·L-1；3AB溶液配制濃度為10 mmol·L-1；BrdU溶液配制濃度為10 mmol·L-1。

1.2.2SD大鼠乳鼠原代心肌細胞培養(yǎng) 用酒精消毒1～3 d的已麻醉的SD大鼠乳鼠腹部表面，開胸將心臟轉移至含有預冷PBS溶液的平皿中，在PBS中除去殘血及結蹄組織后，將心臟均勻剪成大小為1 mm3的組織塊。隨即轉移至錐形瓶中，PBS洗滌后，加入15 mL的0.8 g·L-1胰蛋白酶進行冷消化20 min。之后用0.8 g·L-1胰蛋白酶，于磁力攪拌器上37 ℃水浴攪拌消化，離心收集細胞。多次反復消化至組織塊消化完全，后于兩個25 cm2培養(yǎng)瓶中(以14只乳鼠心肌細胞量為例)，于培養(yǎng)箱中孵育1 h差速培養(yǎng)，分離成纖維細胞與心肌細胞。按需求稀釋心肌細胞并種皿，培養(yǎng)24 h等待心肌細胞貼壁，換液，24 h后進行后續(xù)處理。注意在培養(yǎng)基中加入0.1 mmol·L-1BrdU來抑制殘余的成纖維細胞生長。

1.2.3Western blot檢測 實驗處理的細胞加入適量RIPA裂解液，在冰上裂解30 min后，12 000×g離心15 min，取上清進行BCA蛋白定量，與5×上樣緩沖液制備成蛋白樣品。SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉膜后，封閉1 h，用TBST洗滌3次后，在4 ℃孵育一抗過夜，TBST洗滌3次后，在室溫下孵育相應的二抗1 h，TBST洗滌3次，進行化學發(fā)光顯影檢測。

1.2.4qPCR檢測 棄去細胞培養(yǎng)基，PBS洗滌后，用TRIzol將細胞轉入EP管。室溫下加入氯仿，劇烈震蕩后，將含RNA的水相層轉移入另一新EP管。加入異丙醇混勻，室溫下靜置后離心得到RNA沉淀。用DEPC水配制的75%的乙醇洗滌沉淀，再次離心后吸凈上清，在室溫下干燥，適量加入DEPC水，溶解RNA以檢測RNA的純度、濃度。使用逆轉錄試劑盒，參照說明書進行逆轉錄反應合成cDNA。參照SYBY Premix ExTaq的說明書，進行反應體系構建。PCR儀參數(shù)如下：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)50次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 h；65 ℃ 30 s，循環(huán)61次。引物由上海生工公司合成，采用β-actin為內參基因。引物序列如下：β-actin：正向5′-TCGTGCGTGACATTAAAGAG-3′，反向5′-ATTGCCGATAGTGATGACCT-3′；ANF：正向5′-CCGTATACAGTGCGGTGTCC-3′，反向5′-CAGAGAGGGAGCTAAGTGCC-3′；BNP：正向5′-AGCTGCTTTGGGCAGAAGAT-3′，反向5′-AAAACAACCTCAGCCCGTCA-3′。

1.2.5細胞水平干預PARP1 過表達PARP1蛋白采用PARP1腺病毒(Ad-PARP1)感染原代心肌細胞48 h，含綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)為對照組，病毒購于上海吉凱基因化學技術有限公司。敲低PARP1蛋白以8 cm2小皿為例，分別用250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基與5 μL Lipo-2000、10 μL濃度為20 μmol·L-1的干擾序列，輕柔混勻，室溫靜置5 min后混勻，靜置20 min后，一并加入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。6 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)。PARP1干擾序列：sense：5′-GGGACUAACUCCUAUUACATT-3′，antisence：5′-UGUAAUAGGAGUUAGUCCCTT-3′[7]。

1.2.6心肌肥大動物模型的建立 20只SD大鼠隨機分為對照組與模型組，模型組大鼠皮下注射1.2 mg·kg-1·d-1的ISO，連續(xù)7 d，對照組注射等量生理鹽水。之后，用7%水合氯醛麻醉SD大鼠，迅速打開胸腔，灌注0.1 mol·L-1KCl溶液后，使心臟停止跳動，取出心臟進行外觀拍攝后，沿橫截面分切，部分固定于4%的多聚甲醛，24 h后進行石蠟包埋切片，HE染色；剩余部分凍存于液氮中，提取組織蛋白后，用免疫印跡法檢測相關蛋白的表達。

1.2.7免疫熒光共定位 將細胞種于激光共聚集顯微鏡專用的Confocal小皿中，根據(jù)需求分組處理后，棄去培養(yǎng)基，用37 ℃的PBS輕輕洗滌去殘余的培養(yǎng)基，在皿中加入1 mL 4%的多聚甲醛，室溫下固定15 min。棄去多聚甲醛，在室溫下干燥10 min。用PBS清洗3次，加入預配制好體積分數(shù)為1%的Triton破膜15 min。棄去破膜液，用PBS清洗3次后，加入10%的山羊血清室溫下封閉1 h。除去山羊血清，分別加入一抗4 ℃過夜。次日，加入對應的熒光二抗(1 ∶100)，室溫下避光孵育1 h。用PBS洗3次，DAPI染細胞核3 min后，PBS清洗3次，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。

1.2.8核蛋白提取 使用核蛋白抽提試劑盒進行核蛋白的提取，核蛋白提取采用70 mm的中皿。除去培養(yǎng)基后用預冷的PBS/PI清洗3次，棄去，加入1 mL的PBS/PI輕柔刮下細胞，轉移至預冷的1.5 mL EP管中。4 ℃、1 200×g離心10 min后，棄上清。用50 μL 1×Hypotonic Buffer重懸細胞，在冰上孵育15 min。加入12.5 μL的去污劑，劇烈渦旋后，4 ℃、14 000×g離心30 s。離心后上清為胞質蛋白，沉淀為核蛋白。用25 μL的完全裂解液重懸沉淀，劇烈渦旋后，在冰上搖擺孵育30 min。隨后劇烈渦旋30 s，再次離心10 min，上清即為核蛋白。用考馬斯亮藍法分別對核蛋白、胞質蛋白進行定量后，制備樣品以備后續(xù)的Western blot檢測。

1.2.9實驗分組 (1)肥大指標的檢測分為Control組和ISO組；(2)NFATs胞質、胞核蛋白檢測設立ISO時間點為0、1、3、6 h；(3)免疫熒光共定位檢測，依據(jù)NFATc3和NFATc4分設Control組和ISO組；(4)動物心臟組織中NFATs胞質、胞核蛋白檢測分設NS組和ISO組；(5)過表達PARP1后，NFATs胞質、胞核蛋白檢測分為過表達GFP蛋白和過表達PARP1蛋白兩組；(6)抑制PARP1功能后，胞質、胞核蛋白檢測分為對照組、單獨ISO刺激組、合并給予ISO+3AB組；(7)敲低PARP1后，NFATs胞質、胞核蛋白檢測分為對照組、ISO組、si PARP1組、si PARP1合并給予ISO四組。

2 結果

2.1 心肌肥大細胞模型中ISO刺激NFATs發(fā)生轉位入核Fig 1A結果顯示，與對照組相比，原代心肌細胞在10 μmol·L-1的ISO刺激24 h下，經(jīng)羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色，在熒光顯微鏡下可以觀察到心肌細胞表面積明顯變大，而高內涵系統(tǒng)測定總體細胞表面積明顯上升，并具有統(tǒng)計學差異。同時，我們進一步檢測了對照組和ISO刺激下ANF、BNP、β-MHC的mRNA水平變化。Fig 1B結果顯示，在ISO刺激下，ANF、BNP、β-MHC mRNA水平均明顯上調，進一步確定ISO誘導心肌肥大模型成功。

如Fig 1C所示，10 μmol·L-1的ISO分別刺激原代心肌細胞0、1、3、6 h后，結果發(fā)現(xiàn)，在沒有ISO刺激時，NFATc3和NFATc4在細胞核與細胞質中均有明顯分布，而隨著ISO刺激時長的增加，NFATc3和NFATc4發(fā)生了核轉位，導致核內NFATc3和NFATc4增多，而細胞質的NFATc3和NFATc4減少。由Fig 1D的免疫熒光結果可以直觀地看到，與對照組相比，NFATc3、NFATc4細胞核的共定位情況明顯增加，進一步說明了在ISO的刺激下，NFATc3和NFATc4的入核增加。

2.2 心肌肥大動物模型中ISO同樣刺激NFATs發(fā)生轉位入核Fig 2A的結果顯示，ISO刺激引起了SD大鼠的心臟外觀較對照組明顯變大，同時由Fig 2B的HE染色結果可以看到，ISO引起心肌細胞明顯變大，心肌細胞排列紊亂。如Fig 2C所示，ISO組的ANF蛋白表達量明顯上調，以上結果表明在ISO刺激下，SD大鼠的心臟發(fā)生肥大。在成功建立了心肌肥大的動物模型后，我們檢測了心臟組織NFATc3和NFATc4的亞細胞定位情況，與細胞實驗結果一致，ISO分別引起了核內的NFATc3和NFATc4入核增加，而細胞質中的蛋白量減少，說明在動物水平上，ISO同樣可以刺激心臟中的NFATc3和NFATc4由細胞質轉位入核，發(fā)揮轉錄調控作用。

2.3 ISO引起PARP1酶活性上升，過表達PARP1引起NFATc3和NFATc4轉位入核如Fig 3A所示，給予ISO刺激后，細胞內的PAR化程度增加，但是PARP1的蛋白表達量卻無明顯變化，而在ISO誘導的大鼠心肌肥大模型中(Fig 3B)，我們檢測到了同樣的結果。這些實驗結果表明，無論是在心肌細胞水平，還是整體動物水平，ISO誘導的病理性心肌肥大模型中，PARP1的酶活性升高，而其蛋白表達量未發(fā)生明顯改變。

為了探討PARP1對NFATs的影響，我們使用PARP1的腺病毒(Ad-PARP1)進行過表達，觀察NFATc3和NFATc4的亞細胞定位的改變。如Fig 4A所示，與對照組Ad-GFP相比，Ad-PARP1組的NFATc3和NFATc4蛋白由細胞質轉位進入細胞核。為了進一步探究PARP1和NFATc3、NFATc4及心肌肥大的關系，分別設置對照組、單獨加入ISO刺激組、合并加入了ISO刺激和PARP1抑制劑3AB組。Fig 4B結果提示，單獨給予ISO，可以促進NFATs的入核轉運，相較于單獨ISO組，ISO合并3AB組明顯使NFATc3和NFATc4的細胞質蛋白含量增加，而核內蛋白含量減少，說明NFATc3和NFATc4的轉位入核可能與PARP1的酶活性增強有關。我們進一步通過轉染靶向PARP1的siRNA敲低PARP1表達，F(xiàn)ig 4C結果顯示，敲低PARP1使ISO引起的NFATc3、NFATc4入核減少。進一步證明NFATc3和NFATc4的轉位入核與PARP1關系密切。

Fig 1 ISO affected nuclear translocation of NFATc3 and NFATc4 in primary neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs)

3 討論

病理性心肌肥大的發(fā)生機制十分復雜，過度的心肌肥大最終會導致心臟重構，進而導致心衰。研究表明，心臟中的β腎上腺受體的長時間激活可以導致心肌肥大和左心室功能失調，最終發(fā)展為心衰。β腎上腺受體的激活，可通過介導心肌生長因子等途徑，促進心肌蛋白的合成，也可進一步激活環(huán)磷酸腺苷通路，使心肌細胞中的cAMP含量升高，引發(fā)下游一些與心肌肥大密切相關的轉錄因子及信號通路的活化，進而發(fā)生心肌肥大。還可以通過影響肌漿網(wǎng)的Ca2+水平，進而誘導Ca2+的釋放，影響心肌收縮功能的改變[10]。研究同樣表明，在引起心肌肥大的同時，可以檢測到Ca2+水平升高，促進CaMKⅡδB表達，誘導心肌肥大[11]。目前，ISO已經(jīng)成為病理性心肌肥大常用的造模藥物。在本研究中，在心肌原代細胞中，給予10 μmol·L-1的ISO刺激24 h；在動物實驗中，對SD大鼠皮下注射1.2 mg·kg-1·d-1的ISO，連續(xù)7 d，成功建立病理性心肌肥大模型。

Fig 2 ISO promoted nuclear translocation of NFATc3 and NFATc4 in ISO-induced cardiac hypertrophy in

SD rats were submitted to the s.c. injection of ISO (1.2 mg·kg-1·d-1) for 7 days. The control animals obtained normal saline (NS). A, B：Hypertrophic changes of the hearts were observed by gross morphologic examination (A) and HE staining (B). C：The protein expression of ANF was detected by Western blot; D：Western blot analysis showed the subcellular localization of NFATc3 and NFATc4 of the hearts.*P<0.05vsNS group.

Fig3ISOincreasedactivityofPARylationwithoutaffectingproteinexpressionofPARP1bothinvivoandinvitro

The changes of activity of PARylation and the protein expression of PARP1 were detected in NRCMs (A) or SD rats (B) treated with NS or ISO by Western blot.

Fig 4 PARP1 promoted shuttling between nucleus and cytoplasm of NFATc3 and

A：The subcellular localization changes of NFATc3 and NFATc4 were detected by Western blot in cultured NRCMs infected with Ad-PARP1 or Ad-GFP; B：The subcellular localization of the NFATc3 and NFATc4 was observed in cultured NRCMs treated with PARP1 inhibitor 3AB or in the presence of ISO by Western blot; C：NRCMs were transfected with siRNA targeting PARP1 or negative control siRNA (NC), and Western blot was performed to compare the subcellular localization changes of NFATc3 and NFATc4(Nuc and Cyto: 1. NC； 2. NC+ISO； 3. siPARP1； 4. siPARP1+ISO).*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsISO group.

NFATs家族是一類Ca2+/CaN依賴的轉錄因子，其在結構上存在兩個串聯(lián)結構域NFAT同源區(qū)(NFAT-homology region，NHR)，DNA結合域(DNA binding domain，DBD)，而核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)則在其NHR和DBD兩個區(qū)域。在靜止狀態(tài)下，NFAT的調節(jié)結構域因呈高度磷酸化狀態(tài)而限制了其轉位入核，主要分布于細胞質之中。而在進一步去磷酸化后，則可以促使NFATs的核定位序列暴露，進而轉位入核[12]。而前述轉位入核的NFATs可通過調控BNP的轉錄，從而影響心肌肥大。我們在ISO心肌肥大細胞模型和動物模型中，觀察到NFATc3和NFATc4均發(fā)生了明顯的核轉位現(xiàn)象，由細胞質轉位進入了細胞核。

PARPs是一類能夠將NAD的核糖基轉移到底物上，發(fā)揮PAR化修飾的聚合酶蛋白家族。其中，PARP1亞型與心肌肥大、心衰的關系最為密切，也是該家族的優(yōu)勢亞型，引起研究者們廣泛的關注。在本實驗室的前期研究中，發(fā)現(xiàn)PARP1可以通過PAR化修飾FoxO3，促進了FoxO3的磷酸化，從而抑制其轉錄活性，導致心肌肥大。另一報道則直接表明，在T細胞中，PARP1可直接PAR化NFATs的DNA結合域，進而提高NFATs與核內DNA的結合能力，進而調節(jié)轉錄[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在ISO刺激下，PARP1表達量并無明顯變化，但其PAR化酶活性卻明顯上升。過表達PARP1也可誘導NFATc3和NFATc4轉位入核。而使用PARP1的抑制劑3AB以及敲低了PARP1之后，均可以減少ISO引起的轉位入核，這一結果提示，ISO引起的NFATc3、NFATc4轉位入核可能與PARP1密切相關。

在ISO刺激下，PARP1的PAR化酶活性上升，細胞質中的NFATc3和NFATc4向細胞核內聚集。我們推測，活化的PARP1可能通過PAR化修飾細胞核中的NFATc3和NFATc4，穩(wěn)定NFATc3和NFATc4的去磷酸化狀態(tài)，延長其在細胞核內的存留。又由于PARP1可以PAR化NFATs的DNA結合區(qū)，導致其與DNA的結合能力加強，進而使其調節(jié)轉錄能力上升，促進肥大基因的進一步轉錄表達，促進心肌肥大的發(fā)生。但其具體調節(jié)機制仍待進一步研究。

研究表明，在ISO刺激下，NFATc3和NFATc4上游發(fā)揮去磷酸化功能的蛋白被激活，導致NFATc3和NFATc4的調節(jié)結構域被去磷酸化，核定位序列暴露，從而轉位入核[14]。那么這一上游是什么呢？我們實驗室發(fā)現(xiàn)，PARP1可以促進FoxO3、NFATs的核內聚集，那么二者之間又有何聯(lián)系呢，也是我們以后的研究方向之一。