李釗全，粟正英，梁丹丹，王春苗，藍(lán) 富，李俊瑩，田 煒，黎丹戎，侯華新

(廣西醫(yī)科大學(xué)1. 藥學(xué)院，2. 生命科學(xué)研究院， 廣西 南寧 530021；3. 廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部， 廣西 南寧 530201)

Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，RAC1)是小分子G蛋白R(shí)ho GTPase家族Rac亞家族蛋白中的一員。大量文獻(xiàn)報(bào)道，RAC1在細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、軸突形成等調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[1]。RAC1在多種類(lèi)型的惡性腫瘤中異常表達(dá)，包括肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、子宮頸癌等。RAC1在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)會(huì)干擾細(xì)胞之間的黏附作用，促進(jìn)細(xì)胞侵襲、遷移及腫瘤新生血管形成等[2]。解娜等[3]利用RNAi技術(shù)沉默結(jié)腸癌細(xì)胞RAC1的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖速度明顯降低，并且能抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)RAC1的表達(dá)水平，有助抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。朱琳等[4]發(fā)現(xiàn)，RAC2能通過(guò)增強(qiáng)NADPH氧化酶活性，明顯提高活性氧水平，增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞的輻射敏感性。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)高發(fā)于我國(guó)華南、西南地區(qū)，是常見(jiàn)惡性腫瘤之一。放療是NPC患者的主要治療手段，但常發(fā)生放射抗拒，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。在課題組前期研究中，采用iTRAQ聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)蒽醌化合物GXHSWAQ-1可調(diào)控NPC CNE1細(xì)胞RAC1蛋白表達(dá)，從而增加細(xì)胞對(duì)射線的敏感性[5]。這些研究結(jié)果提示，RAC1可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵蛋白，可作為潛在的治療靶點(diǎn)。

基于靶點(diǎn)設(shè)計(jì)與合成的候選化合物，其活性篩選的方法多種多樣。螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光原理創(chuàng)建的一類(lèi)新型藥物篩選方法，具有高特異性、高靈敏度、不受激發(fā)光干擾、高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)，目前在靶點(diǎn)的篩選和驗(yàn)證應(yīng)用中越來(lái)越廣泛。本研究利用RAC1基因啟動(dòng)子序列，構(gòu)建了螢光素酶-慢病毒重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至NPC CNE1細(xì)胞中，獲得能穩(wěn)定表達(dá)RAC1螢光素酶的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，通過(guò)螢光素酶活性和Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)課題組設(shè)計(jì)合成的系列化合物對(duì)RAC1靶向調(diào)控活性，為靶向RAC1的抗腫瘤化合物的篩選及修飾提供技術(shù)平臺(tái)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒及細(xì)胞株 pLVX-AcGFP-Puro，由上海伯易生物科技有限公司提供。人高分化鼻咽鱗癌CNE1細(xì)胞，由廣西腫瘤防治研究所提供。

1.1.2試劑與儀器 限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI、T4連接酶，購(gòu)自日本TaKaRa公司；LipofectamineTM2000，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；嘌呤霉素，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(ONE-GloTMReagent)，購(gòu)自美國(guó)Promega公司；GAPDH多克隆抗體，購(gòu)自廣州晶欣生物科技有限公司；RAC1單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；EVOS FL Auto全自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)(美國(guó)Life Scientific公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀Microplate reader(美國(guó)Bio-Tek公司)；Odessey雙色紅外成像系統(tǒng)(美國(guó)Licor公司)。

1.1.3受試化合物 化合物4a、H、B、C為課題組設(shè)計(jì)合成的系列大黃酸衍生物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)紅外、質(zhì)譜以及核磁共振波譜確證，化合物純度經(jīng)高效液相檢測(cè)，達(dá)到98%以上，各化合物結(jié)構(gòu)見(jiàn)Fig 1。大黃酸(rhein)，購(gòu)自南京郎澤生物醫(yī)藥；RAC1激活劑PMA，購(gòu)自美國(guó)Cayman Chemical公司；RAC1抑制劑NSC23766，購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals公司。

1.2 含RAC1啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因細(xì)胞模型的構(gòu)建與驗(yàn)證含RAC1啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因細(xì)胞模型的構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)Fig 2。

1.2.1含RAC1啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建 以人RAC1啟動(dòng)子序列(GenBank：NM_006908)為靶序列，設(shè)計(jì)合成RAC1-promoter-Luc2重組序列，并加入EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)，經(jīng)全基因合成后，獲得質(zhì)粒為pUC57-RAC1-promoter-Luc2載體。用EcoRI和BamHI對(duì)該載體和pLVX-AcGFP-Puro載體分別進(jìn)行酶切獲得目的片段，經(jīng)PCR擴(kuò)增和T4連接酶連接。重組構(gòu)建pLVX-RAC1-Luc2-GFP-Puro質(zhì)粒，并經(jīng)酶切電泳和測(cè)序進(jìn)行鑒定。

1.2.2慢病毒包裝 將1.5×106個(gè)293T細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至細(xì)胞約80%融合。用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，將重組質(zhì)粒和病毒包裝質(zhì)?；旌?。轉(zhuǎn)染48 h后，500×g離心10 min，收集病毒上清。

1.2.3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE1細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔的密度接種到6孔板。加入4 μL濃度為5 g·L-1的聚凝胺和500 μL的病毒液。病毒感染24 h后，撤去病毒液，胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞按1 ∶100的稀釋倍數(shù)接種至T75 cm2的培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞貼壁24 h后，加入含2 ng·L-1嘌呤霉素的培養(yǎng)基，連續(xù)篩選2周，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞感染效率。獲得穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶的CNE1細(xì)胞株，命名為CNE1-RAC1-Luc2。

Fig 1 Chemical structure of different tested compounds

Fig 2 Workflow for construction of a cell model of luciferase reporter gene with RAC1 promoter

1.2.4螢光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE1和CNE1-RAC1-Luc2細(xì)胞,以5×103個(gè)/孔的濃度接種于螢光素酶檢測(cè)專(zhuān)用的白色96孔板中，每孔細(xì)胞懸液100 μL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁24 h后，按照試劑盒(ONE-GloTMReagent)說(shuō)明書(shū)，每孔加入100 μL含底物裂解液，于酶標(biāo)儀上振蕩裂解3 min后，立即檢測(cè)各組細(xì)胞螢光素酶發(fā)光信號(hào)值。

1.2.5含RAC1螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)的驗(yàn)證 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE1-RAC1-Luc2細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔的數(shù)量接種于螢光素酶檢測(cè)專(zhuān)用的白色96孔板中，每孔細(xì)胞懸液體積100 μL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁24 h后，分別加入濃度為對(duì)細(xì)胞抑制率小于20%的PMA(1.5 μmol·L-1)、NSC23766(30 μmol·L-1)，孵育24 h后，按“1.2.4”的方法檢測(cè)各組細(xì)胞螢光素酶發(fā)光信號(hào)值。

1.2.6Western blot檢測(cè)RAC1激活劑與抑制劑對(duì)RAC1蛋白表達(dá)的調(diào)控 以無(wú)細(xì)胞毒濃度的RAC1激活劑與抑制劑處理細(xì)胞，以等量的完全培養(yǎng)液為空白對(duì)照。作用24 h后，加入RIPA/PMSF細(xì)胞裂解液，收集上清即為蛋白提取液。取100 μg蛋白樣品，12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜。NC膜置于5%脫脂牛奶的TBST中孵育2 h。加入一抗RAC1(1 ∶500)和GAPDH(1 ∶1 000)孵育。加入遠(yuǎn)紅外熒光二抗(1 ∶10 000)室溫孵育,使用Odyssey紅外掃膜儀掃描蛋白條帶，通過(guò)灰度值統(tǒng)計(jì)軟件測(cè)定各組樣品灰度值。

1.3 受試化合物活性檢測(cè)選取無(wú)細(xì)胞毒濃度的大黃酸衍生物4a(20 μmol·L-1)、H(2 μmol·L-1)、B(5 μmol·L-1)、C (5 μmol·L-1)、大黃酸(20 μmol·L-1)為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)置不加藥的空白對(duì)照組。各化合物作用CNE1-RAC1-Luc2細(xì)胞24 h后，按“1.2.4”的方法檢測(cè)各組細(xì)胞螢光素酶發(fā)光信號(hào)值。同時(shí)，收集經(jīng)上述各化合物處理24 h后的各組細(xì)胞，裂解后，采用Western blot檢測(cè)各化合物對(duì)RAC1蛋白表達(dá)的影響。

2 結(jié)果

2.1 pLVX-RAC1-Luc2-GFP-Puro螢光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒鑒定含有RAC1基因啟動(dòng)子片段的重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后，在Fig 3條帶1中的4 000 bp和9 000 bp附近可見(jiàn)到兩條明亮的條帶，與插入的RAC1-Luc2(3 700 bp左右)目的片段和pLVX-AcGFP-Puro(8 700 bp左右)載體片段長(zhǎng)度一致，表明目的序列成功插入且序列大小正確，經(jīng)過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)目的序列與預(yù)期設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列完全一致，螢光素酶重組報(bào)告質(zhì)粒成功構(gòu)建。

2.2 CNE1-RAC1-Luc2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選經(jīng)濃度為2 ng·L-1的嘌呤霉素連續(xù)篩選2周后，獲得穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶的CNE1-RAC1-Luc2細(xì)胞，細(xì)胞感染綠色熒光(GFP)效率達(dá)90%以上，見(jiàn)Fig 4。

2.3 CNE1-RAC1-Luc2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞螢光素酶活性檢測(cè)Fig 5的螢光素酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以不感染病毒的CNE1細(xì)胞為空白對(duì)照，感染了慢病毒的CNE1-RAC1-Luc2細(xì)胞螢光素酶活性明顯高于空白對(duì)照(P<0.05)。結(jié)果表明，RAC1基因啟動(dòng)子序列已經(jīng)準(zhǔn)確插入到螢光素酶基因上游，并在CNE1細(xì)胞內(nèi)正常啟動(dòng)螢光素酶基因的表達(dá)。

Fig 3 Electrophoresis of recombinant plasmid of pLVX-PRAC1-Luc2-GFP-Puro digested with double restriction endonuclease

M：DNA marker; 1：Digested with EcoRI/BamHI; 2：Plasmid DNA.

Fig 4 Expression efficiency of green fluorescence protein in CNE1-RAC1-Luc2 cells(×100)

Fig 5 Expression activity of luciferase in CNE1-RAC1-Luc2

**P<0.01vscontrol

2.4 RAC1螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)篩選活性驗(yàn)證采用無(wú)細(xì)胞毒濃度的RAC1激活劑PMA和抑制劑NSC23766作用CNE1-RAC1-Luc2細(xì)胞48 h后，檢測(cè)對(duì)細(xì)胞螢光素酶RAC1活性的影響。如Fig 6A所示，與空白對(duì)照相比，RAC1激活劑PMA可提高螢光素酶活性(P<0.05)，而RAC1抑制劑NSC23766抑制細(xì)胞的螢光素酶活性(P<0.05)。同時(shí)，采用Western blot檢測(cè)NSC23766和PMA對(duì)RAC1蛋白表達(dá)的影響，如Fig 6B所示，與空白對(duì)照相比，NSC23766能有效下調(diào)CNE1細(xì)胞RAC1蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，而PMA則相反(P<0.05)。

Fig 6 Validation of screening activity of RAC1 by

A：Effects of NSC23766 and PMA on luciferase activity of CNE1-RAC1-Luc2 cells; B：Expression of RAC1 after treatment with NSC23766 and PMA by Western blot.*P<0.05vscontrol.

2.5 系列化合物對(duì)RAC1的靶向調(diào)控作用大黃酸及其衍生物B、C、4a、H以無(wú)細(xì)胞毒濃度作用CNE1-RAC1-Luc2細(xì)胞48 h后，檢測(cè)各組細(xì)胞螢光素酶活性的變化。與空白對(duì)照相比，大黃酸及衍生物C能夠增加螢光素酶活性(P<0.05)；而衍生物4a、H可抑制細(xì)胞的螢光素酶活性(P<0.05)，衍生物B基本上不影響螢光素酶活性的變化(Fig 7A)。Fig 7B的Western blot結(jié)果顯示，相比于空白對(duì)照，大黃酸及其衍生物C上調(diào)RAC1的表達(dá)(P<0.05)，衍生物4a、H下調(diào)RAC1蛋白的表達(dá)(P<0.05)。

3 討論

大多數(shù)藥物通過(guò)與體內(nèi)分子“靶標(biāo)”的相互作用而產(chǎn)生療效,靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)已成為當(dāng)今創(chuàng)新藥物研究的焦點(diǎn)。目前，基于RAC1為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選、設(shè)計(jì)合成的研究已有一些報(bào)道。Xie等[6]發(fā)現(xiàn)，一個(gè)新型天然大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物F086能通過(guò)下調(diào)RAC1，抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞骨架的裝配，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Montalvoortiz等[7]還發(fā)現(xiàn)了一種新的Rac抑制劑EHop-016，比已有的Rac抑制劑效果更好,并在白血病治療中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。因此，以RAC1及其下游信號(hào)通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建，對(duì)促進(jìn)靶向RAC1的抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)與研發(fā)有積極意義。

迄今已報(bào)道的螢光素酶報(bào)告基因藥物篩選體系主要有：(1)受體激動(dòng)劑/抑制劑的篩選體系[8]；(2)信號(hào)通路的篩選體系[9]；(3)靶基因3’非編碼區(qū)(3′UTR)的篩選體系[10]；(4)靶基因啟動(dòng)子的篩選體系[11]。前3種方法由于存在靶向性低、假陽(yáng)性或假陰性等結(jié)果的弊端，未能在藥物的篩選中有效使用。基因啟動(dòng)子含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列，能對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控[12-13]。因此，基于靶基因啟動(dòng)子的靶向藥物篩選體系與上述3種體系相比具有一定的優(yōu)越性，可以特異性篩選引起目的基因轉(zhuǎn)錄活性改變的活性小分子。本研究根據(jù)RAC1啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)合成pLVX-RAC1-Luc2-GFP-Puro螢光素酶-慢病毒重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至CNE1細(xì)胞中，成功獲得穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶的CNE1-RAC1-Luc2細(xì)胞，為篩選靶向調(diào)控RAC1基因啟動(dòng)子活性和RAC1蛋白表達(dá)活性的候選化合物提供了一個(gè)實(shí)用的細(xì)胞模型。

Fig 7 Targeted regulation of RAC1 by a series

A：Effects of a series of rhein derivative compounds on luciferase activity; B：Expression of RAC1 after treatment with a series of rhein derivative compounds by Western blot.*P<0.05vscontrol.

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，含蒽醌母核結(jié)構(gòu)的大黃素、大黃酸及多種蒽醌類(lèi)化合物，可以靶向調(diào)控RAC1活性，增加NPC細(xì)胞對(duì)射線的敏感性，抑制卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲[14-15]。本研究所使用的受試物為在大黃酸蒽醌母核結(jié)構(gòu)上引入喹唑啉環(huán)的系列化合物，期待能發(fā)現(xiàn)更多活性高、毒性低，針對(duì)RAC1靶向性良好的化合物。采用含RAC1啟動(dòng)子的螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)：受試化合物對(duì)RAC1螢光素酶的活性的激活或抑制與Western blot結(jié)果一致。研究結(jié)果表明，所構(gòu)建的含RAC1啟動(dòng)子的螢光素酶報(bào)告基因的細(xì)胞模型可用于靶向調(diào)控RAC1啟動(dòng)子化合物的篩選，具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，可指導(dǎo)針對(duì)RAC1為靶點(diǎn)的化合物設(shè)計(jì)、修飾與篩選，提高藥物的研發(fā)效率。