■曹金博 王 耀 胡驍飛 鄧瑞廣 李燕虹 孟繼秋 古紹彬*

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 食品加工與安全國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南洛陽(yáng)471023；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002）

四環(huán)素類(lèi)抗生素是由放線(xiàn)菌產(chǎn)生的一類(lèi)廣譜性抗生素，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌可起到抑制殺菌的作用，如葡萄球菌、芽孢桿菌、肺炎桿菌、溶血性鏈球菌、立克次氏體等[1]。因此，被廣泛的用于治療各種感染性疾病，而微量添加在飼料或動(dòng)物飲水中則可用于預(yù)防疾病，提高飼料的利用率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)等[2-3]。四環(huán)素類(lèi)抗生素因其廣譜的抑菌效果以及低廉的價(jià)格，是目前世界上使用最廣泛、用量最大的抗生素之一。但近年來(lái)，四環(huán)素類(lèi)抗生素在禽畜養(yǎng)殖中的違規(guī)濫用現(xiàn)象非常嚴(yán)重[4]，藥物使用不規(guī)范以及無(wú)休藥期，導(dǎo)致四環(huán)素類(lèi)抗生素在動(dòng)物源性食品中大量殘留，并最終在人們食用之后蓄積在體內(nèi)，嚴(yán)重危害人身健康[5]。同時(shí)動(dòng)物體內(nèi)未被吸收的一部分四環(huán)素類(lèi)抗生素以母體化合物的形態(tài)排出體外，進(jìn)入環(huán)境中之后難以降解，除造成化學(xué)污染外，還可誘導(dǎo)抗性基因和抗性微生物的產(chǎn)生，進(jìn)而危害人類(lèi)健康[6-7]。因此，為加強(qiáng)我國(guó)動(dòng)物性食品安全檢測(cè)，建立簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留檢測(cè)方法十分必要。

1 四環(huán)素類(lèi)抗生素概述

1.1 性質(zhì)及其作用機(jī)制

四環(huán)素類(lèi)抗生素（Tetracyclines，TCs）是由放線(xiàn)菌等產(chǎn)生的一種能夠抑制、殺滅大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌等病菌的廣譜抗菌劑，TCs 主要包括天然合成的四環(huán)素（Tetracycline，TC）、金霉素（Chlor?tetracycline，CTC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC），以及化學(xué)半合成的強(qiáng)力霉素（Doxycycline，DC）等[8]，其基本結(jié)構(gòu)式如圖1 所示，都具有相似母體結(jié)構(gòu)，不同之處在于取代基的不同，具體見(jiàn)表1。四環(huán)素類(lèi)抗生素呈黃色粉末狀，水溶性較差，遇光易分解，因含有酚羥基、烯醇羥基以及二甲氨基，屬于酸堿兩性化合物[9]。

圖1 四環(huán)素類(lèi)抗生素基本化學(xué)結(jié)構(gòu)

表1 主要四環(huán)素類(lèi)抗生素具體取代基

四環(huán)素類(lèi)抗生素作為一種快速的抑菌劑，在高濃度狀態(tài)下殺菌效果顯著，其作用機(jī)制主要有以下三點(diǎn)：一是四環(huán)素類(lèi)抗生素與細(xì)菌核糖體30s 亞基上的受體特異性結(jié)合，從而阻止相應(yīng)的tRNA 在該位點(diǎn)上的結(jié)合，最終抑制蛋白質(zhì)的合成[10]；二是四環(huán)素類(lèi)抗生素通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致參與DNA 復(fù)制的核苷酸以及其他一些重要的成分外漏，從而無(wú)法完成DNA 復(fù)制和蛋白質(zhì)的表達(dá)，最終起到抑制和殺死細(xì)菌的作用[11]；三是目前增加的一種新的解釋?zhuān)沫h(huán)素類(lèi)抗生素能夠干擾延伸因子（Tu），影響其與核糖體之間的相互作用，或者是在反密碼子識(shí)別密碼子時(shí)破壞了Tu與tDNA的作用[12]。

1.2 危害及限量標(biāo)準(zhǔn)

目前，四環(huán)素類(lèi)抗生素主要應(yīng)用在禽畜養(yǎng)殖以及水產(chǎn)養(yǎng)殖中，但其在動(dòng)物源性產(chǎn)品以及環(huán)境中大量殘留，隨之帶來(lái)的危害以及負(fù)面效應(yīng)也逐漸凸顯出來(lái)。造成大量殘留的原因有以下三點(diǎn)：一是養(yǎng)殖者不按照規(guī)范用藥，為短時(shí)間內(nèi)控制病情加大四環(huán)素類(lèi)抗生素的使用量；二是為掩蓋禽畜病態(tài)，在休藥期仍然繼續(xù)使用藥物；三是為控制用藥成本，使用來(lái)源不明的抗生素[13]。

四環(huán)素類(lèi)抗生素的蓄積毒性對(duì)人體危害極大，據(jù)報(bào)道，四環(huán)素類(lèi)抗生素可聚積在骨骼內(nèi)，嚴(yán)重影響身體的發(fā)育，同時(shí)與牙齒中的鈣結(jié)合成難溶黃色鈣化物，形成所謂的“四環(huán)素牙”[14]；肝和腎是人體的解毒器官，四環(huán)素類(lèi)抗生素的大量蓄積可嚴(yán)重?fù)p害肝腎功能，引起脂肪肝變性和腎功能不全[15]；四環(huán)素類(lèi)抗生素的存在也會(huì)導(dǎo)致人體正常菌群的失衡，引發(fā)一些呼吸道、消化道和尿道感染；同時(shí)，四環(huán)素類(lèi)抗生素也會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)，誘發(fā)二重感染以及一些胃腸道反應(yīng)[16]。因此，我國(guó)農(nóng)業(yè)部235 號(hào)公告對(duì)動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類(lèi)抗生素最高殘留限量做出規(guī)定，詳見(jiàn)表2。

表2 主要四環(huán)素類(lèi)抗生素最高殘留量

2 免疫分析技術(shù)

免疫分析技術(shù)利用高親和力抗體對(duì)抗原進(jìn)行特異識(shí)別，并且隨著技術(shù)的成熟與發(fā)展，逐漸引入放射性同位素、熒光素、酶、納米發(fā)光材料等標(biāo)記抗原或抗體，從而在檢測(cè)的特異性和靈敏度方面大大提高[17]。目前，已經(jīng)應(yīng)用到四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留的檢測(cè)的免疫分析技術(shù)主要有放射免疫法（RAI）、酶聯(lián)免疫法（ELI?SA）、膠體金免疫層析法（IGCA）、電化學(xué)免疫法（LCE?CIA）、熒光免疫分析法（FIA）等。以上五種免疫分析方法，在不同領(lǐng)域均已得到廣泛應(yīng)用，其檢測(cè)原理、優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍詳見(jiàn)表3。

2.1 放射免疫法

放射免疫法是一種較早的標(biāo)記免疫分析檢測(cè)技術(shù)，它利用放射性同位素標(biāo)記的抗原同待檢樣品中的抗原競(jìng)爭(zhēng)性的與抗體反應(yīng)，最后通過(guò)分離測(cè)量放射性強(qiáng)度，來(lái)間接地反映樣品中抗原的含量[18]。蘇明明等[19]利用放射免疫分析方法對(duì)采集的6 個(gè)牛血清樣品進(jìn)行四環(huán)素殘留檢測(cè)，其檢測(cè)限為20 μg/kg，該方法操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)，可短時(shí)間內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，但作為一種初篩方法，當(dāng)檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，還需采用其他檢測(cè)方法進(jìn)行確證。Meyer等[20]采集了13個(gè)來(lái)自不同州的湖泊水樣，以及52 個(gè)禽畜養(yǎng)殖密集區(qū)的地表水和地下水樣品，用改進(jìn)的放射免疫法對(duì)樣品中四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明：13 個(gè)湖泊水樣均呈陽(yáng)性，而地表水和地下水的52 個(gè)樣品中僅兩個(gè)成陰性，且這兩份陰性樣品中四環(huán)素類(lèi)抗生素濃度均低于1 μg/kg，用液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示放射免疫法的靈敏度比液相色譜-質(zhì)譜法高1.5倍。放射免疫法采用放射性同位素對(duì)抗原進(jìn)行標(biāo)記，其靈敏度大大提高，顯著縮短了檢測(cè)時(shí)間，但其產(chǎn)生的放射性污染難以處理，這也極大地限制的放射免疫分析方法的普及和應(yīng)用。

表3 各種免疫分析方法對(duì)比分析

2.2 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法是一種經(jīng)典的免疫分析方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種危害物的定性和定量分析[21]。四環(huán)素類(lèi)抗生素屬于小分子危害物，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)時(shí)多采用ELISA 方法的間接競(jìng)爭(zhēng)模式，如圖2 所示，它利用抗原和抗體的特異結(jié)合的能力，首先將包被抗原固定在固相載體上，然后將待檢樣品和一抗混合與固相載體上的包被抗原反應(yīng)，洗去游離成分之后加入酶反應(yīng)底物引發(fā)顯色反應(yīng)，最后根據(jù)顏色反應(yīng)深淺和酶標(biāo)儀所測(cè)吸光度值來(lái)進(jìn)行定量或定性分析[22]。Yanni 等[23]基于制備的高敏感的抗四環(huán)素類(lèi)抗生素單克隆抗體，建立ELISA 方法用于檢測(cè)牛奶和蜂蜜中的四環(huán)素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）。檢測(cè)結(jié)果顯示：TC、OTC、CTC 的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為0.72、3.2、6.4 μg/l；牛奶中回收率分別為：82%～102%、91%～105%、90%～101%，蜂蜜中回收率分別為：88%～101%、89%～101%、89%～95%。此方法可迅速、靈敏的檢測(cè)出牛奶和蜂蜜中的TC、OTC、CTC。Zhan 等[24]開(kāi)發(fā)了一種TC 殘留檢測(cè)ELISA 試劑盒，IC50為0.293 ng/ml，靈敏度為0.05 g/ml，檢出限為3～5 g/ml，變異系數(shù)（CV%）均小于15%，與CTC 的交叉反應(yīng)活性大于60%，與其他抗生素?zé)o交叉反應(yīng)，此試劑盒不僅靈敏度高、特異性強(qiáng)，而且保存時(shí)間較長(zhǎng)，4 ℃條件下可保存6 個(gè)月以上。劉智宏等[25]則建立了一種四環(huán)素類(lèi)藥物多殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，該試劑盒的檢測(cè)限更低為0.3 μg/l，并且可同時(shí)測(cè)定四環(huán)素、金霉素、土霉素和強(qiáng)力霉素4 種藥物殘留，其靈敏度以及精確度均能達(dá)到四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留檢測(cè)的要求。

2.3 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法是基于抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)以及膠體金標(biāo)記技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫分析檢測(cè)方法[26]。利用該方法組裝的膠體金免疫層析試紙可分為：抗原檢測(cè)試紙（雙抗夾心法）、半抗原檢測(cè)試紙（競(jìng)爭(zhēng)法）以及抗體檢測(cè)試紙。針對(duì)小分子物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，多采用半抗原檢測(cè)試紙[27]，其結(jié)構(gòu)如圖3 所示，主要包括樣品墊、結(jié)合墊、檢測(cè)線(xiàn)、質(zhì)控線(xiàn)以及吸水墊等結(jié)構(gòu)。檢測(cè)時(shí)可通過(guò)觀(guān)察檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)顯色情況進(jìn)行定性或定量分析[28]。。付云潔等[29]基于競(jìng)爭(zhēng)原理，利用所制備的單克隆抗體建立了食品中金霉素殘留的膠體金免疫層析試紙，該試紙檢測(cè)限為0.7 μg/ml，檢測(cè)時(shí)間僅需5 min，但當(dāng)食品中存在四環(huán)素且濃度大于1.0 μg/ml 時(shí)，與金霉素存在交叉反應(yīng)。檀尊社等[30]同樣基于所制備的單克隆抗體研發(fā)了一種膠體金免疫層析試紙用于快速檢測(cè)水產(chǎn)樣品中四環(huán)素藥物殘留，該試紙的檢測(cè)限大大降低，為100 ng/ml。與金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素等四環(huán)素族抗生素有很強(qiáng)的交叉反應(yīng)，故可用于同時(shí)檢測(cè)四環(huán)素類(lèi)抗生素藥物殘留。高楠[31]用所建立的四環(huán)素膠體金免疫層析試紙來(lái)檢測(cè)牛奶、豬肉、牛肉、雞肉、魷魚(yú)、大眼鯛魚(yú)等食品中的四環(huán)素，結(jié)果表明，牛奶樣品的檢測(cè)限為40 μg/l，而其余幾種樣品的檢測(cè)限為80 μg/kg，與ELISA 方法相比，具有更高的靈敏度和特異性，且操作簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果穩(wěn)定，可作為四環(huán)素殘留的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控篩檢手段。

圖2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA原理圖

圖3 膠體金免疫層析試紙結(jié)構(gòu)圖

2.4 電化學(xué)免疫傳感器法

電化學(xué)免疫傳感器法是一種結(jié)合免疫分析技術(shù)和電化學(xué)分析技術(shù)所研發(fā)的一種標(biāo)記免疫快速檢測(cè)方法[32]。與其他免疫技術(shù)相比，它在抗原或抗體上標(biāo)記了電化學(xué)反應(yīng)試劑，在于待檢物中相應(yīng)靶標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合前后，會(huì)產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)變化，最終通過(guò)放大指示器顯示[33]。該傳感器既具有免疫檢測(cè)良好的特異性，又具有電化學(xué)分析的高靈敏度，同時(shí)制備簡(jiǎn)單，便于操作，無(wú)放射污染，并可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線(xiàn)檢測(cè)[34]。Liu等[35]以殼聚糖作為連接劑，將四環(huán)素單克隆抗體固定在四氧化三鐵（Fe3O4）納米顆粒修飾的電極上，制備了一種簡(jiǎn)單、靈敏的電化學(xué)免疫傳感器，在對(duì)牛奶中四環(huán)素檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)限為0.032 1 ng/ml，并且在0.08～1 ng/ml范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性電流響應(yīng)。鄭舒[36]則基于三電極體系的電化學(xué)傳感器，采用五氧化二鈮（Nb2O5）作為工作電極，殼聚糖和磁納米粒子作為修飾材料，修飾在Nb2O5表面，最后將四環(huán)素單克隆抗體修飾在其表面，建立了一種電化學(xué)免疫傳感器，用于檢測(cè)牛奶中四環(huán)素殘留，原理如圖4所示。該傳感器在0.04～1 ng/ml 的范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，最低檢測(cè)限為0.022 4 ng/ml，樣品回收率為：95.40%～110.0%。用ELISA 方法進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果和該免疫傳感器的檢測(cè)結(jié)果相似，說(shuō)明其檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖4 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器原理圖

2.5 熒光免疫分析法

熒光免疫分析法是熒光標(biāo)記技術(shù)和免疫分析技術(shù)相結(jié)合的一種新型免疫檢測(cè)方法，該方法靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，可對(duì)重金屬、獸藥殘留、生物毒素、重金屬等進(jìn)行超痕量檢測(cè)[37]。熒光免疫分析法有競(jìng)爭(zhēng)型和夾心型兩種模式，對(duì)小分子進(jìn)行檢測(cè)時(shí)多采用其競(jìng)爭(zhēng)模式，其競(jìng)爭(zhēng)原理基于未標(biāo)記抗原和標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)性的與抗體結(jié)合，最后根據(jù)反應(yīng)液熒光強(qiáng)度間接測(cè)定樣品中抗原含量[38]。唐海波等[39]以熒光納米微球顆粒標(biāo)記抗體，建立的免疫層析檢測(cè)方法可實(shí)現(xiàn)鮮奶中四環(huán)素類(lèi)抗生素的總含量檢測(cè)，該方法對(duì)四環(huán)素的檢測(cè)下限為10 μg/l，對(duì)金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素回收率均達(dá)70%以上，且與其他藥物無(wú)交叉反應(yīng)。李研東等[40]采用量子點(diǎn)標(biāo)記抗體，建立了檢測(cè)四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留的量子點(diǎn)熒光免疫分析方法，IC50為0.9 μg/l，四環(huán)素、金霉素、土霉素的最低檢出限分別為3.0、2.0 μg/kg 和6.0 μg/kg，樣本添加回收率在78.7%～97.0%，與傳統(tǒng)的ELISA 方法相比，具有更高的準(zhǔn)確度和可靠性。Chen 等[41]開(kāi)發(fā)了一種基于近紅外的熒光免疫檢測(cè)方法，可同時(shí)用于檢測(cè)四種抗生素（β-內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素、喹諾酮類(lèi)和磺胺類(lèi)），其中對(duì)四環(huán)素的檢測(cè)限為2 ng/ml，回收率為93.7%～108.2%，變異系數(shù)小于16.3%，該方法檢測(cè)限更低，結(jié)果更精確。

3 小結(jié)

四環(huán)素類(lèi)抗生素種類(lèi)繁多，具有不穩(wěn)定、流動(dòng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，在禽畜及水產(chǎn)養(yǎng)殖中的濫用現(xiàn)象嚴(yán)重，對(duì)我國(guó)動(dòng)物性食品安全監(jiān)控帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。目前，高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等儀器檢測(cè)方法已能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素的精準(zhǔn)檢測(cè)，且選擇性強(qiáng)、分辨率高、假陽(yáng)性低，但此類(lèi)方法在樣品采集和運(yùn)輸過(guò)程中可能會(huì)導(dǎo)致樣品分解，檢測(cè)不及時(shí)，且樣品前處理復(fù)雜、操作繁瑣，不適合現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)篩查。相比之下，免疫分析方法利用高親和力抗體對(duì)抗原進(jìn)行識(shí)別，靈敏度高、特異性強(qiáng)且在大批量樣品以及現(xiàn)場(chǎng)篩查方面具有極大地優(yōu)勢(shì)，但存在容易出現(xiàn)假陰性與假陽(yáng)性結(jié)果等缺點(diǎn)，因此在特異性抗體的制備方面還需進(jìn)一步優(yōu)化和完善。隨著免疫分析技術(shù)的不斷發(fā)展，未來(lái)將有更多檢測(cè)技術(shù)以及具有生物標(biāo)記、示蹤成像功能的新材料應(yīng)用其中，使其不斷的完善。因此，免疫分析技術(shù)在食品安全快速檢測(cè)中將占有越來(lái)越重要的地位，為我國(guó)動(dòng)物性食品安全提供更有利的技術(shù)支撐。