■張明清 周惠強(qiáng) 舒 琥* 郭靜文 鐘東明 侯麗萍 舒 銳

（1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006；3.上海觀星農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海200125）

在過去的幾十年，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)取得了穩(wěn)步的發(fā)展，成功的從“以捕為主”轉(zhuǎn)變?yōu)椤耙责B(yǎng)為主”，極大的滿足了人們對(duì)水產(chǎn)品的需求[1]。但在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的同時(shí)，其也對(duì)周邊的生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了顯著的影響，成為了一種潛在的污染源[2]。這迫使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)向著高密度集約化的養(yǎng)殖方式轉(zhuǎn)變,在這一過程中集裝箱循環(huán)水養(yǎng)殖模式在生產(chǎn)和效益上展現(xiàn)出巨大的優(yōu)越性。集裝箱循環(huán)水養(yǎng)殖模式是以集裝箱為載體，集成了水質(zhì)循環(huán)與檢測(cè)、生物過濾以及物理殺菌等功能，能夠有效凈化水質(zhì)，減少疾病的發(fā)生，具有綠色環(huán)保、健康高效等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。但在集裝箱循環(huán)水養(yǎng)殖過程中，為了進(jìn)一步提高水產(chǎn)品的成活率，常出現(xiàn)抗生素濫用以及耐藥菌產(chǎn)生的情況[5]。而益生菌作為一種飼料添加劑或水體改良劑，具有快速吸收分解水體污染物、提高宿主生長(zhǎng)性能和腸道健康等作用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用[6-8]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究酪酸菌對(duì)集裝箱養(yǎng)殖條件下澳洲寶石鱸生長(zhǎng)性能及腸道菌群的影響，為在集裝箱循環(huán)水養(yǎng)殖中應(yīng)用和推廣酪酸菌提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

實(shí)驗(yàn)飼料包括基礎(chǔ)飼料和酪酸菌飼料（酪酸菌飼料由不同用量的酪酸菌和基礎(chǔ)飼料混勻制得）。實(shí)驗(yàn)所用基礎(chǔ)飼料為恒興牌海水魚膨化配合飼料9912，其主要營(yíng)養(yǎng)水平為（%）：粗蛋白質(zhì)42.0、粗脂肪5.0、粗纖維4.0、鈣1.0～4.0、總磷1.0、氯化鈉0.5～3.0、賴氨酸2.1、水分12.0。按照0.1%、0.5%、1.0%比例稱取酪酸菌（Clostridium butyricum）菌粉，溶于100 ml蒸餾水中混勻，均勻噴灑到基礎(chǔ)飼料上，避光、風(fēng)干后即制成了含有不同濃度酪酸菌的實(shí)驗(yàn)飼料（見表1）。實(shí)驗(yàn)飼料現(xiàn)做現(xiàn)用。

實(shí)驗(yàn)用酪酸菌菌粉由廣東海大集團(tuán)股份有限公司研究院提供，酪酸菌的有效活菌數(shù)為1×1010cfu/g。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料組成

1.2 實(shí)驗(yàn)用魚及養(yǎng)殖管理

實(shí)驗(yàn)用的寶石鱸由上海觀星農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，并在該公司河源養(yǎng)殖基地的集裝箱循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。選取4 800 尾初始體質(zhì)量為（24.02±2.04）g的寶石鱸，隨機(jī)均分到4個(gè)集裝箱中，每個(gè)集裝箱1 200尾魚，每個(gè)集裝箱水體體積均為30 m3。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)對(duì)照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別命名為Control、Diet 1、Diet 2、Diet 3組，對(duì)應(yīng)的酪酸菌添加比例為0、0.1%、0.5%、1.0%。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)持續(xù)60 d。

在實(shí)驗(yàn)期間，每15 d 隨機(jī)撈取30 尾魚測(cè)量一次體質(zhì)量、體長(zhǎng)，測(cè)量前均停食24 h。每天分別于8：00和16：00 各投喂一次，日投喂量為魚體質(zhì)量的4%。實(shí)驗(yàn)期間，該循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)采用自然光源，自來(lái)水水源，保持溶解氧≥6.0 mg/l，pH 值7.0～7.5，氨氮≤8.0 mg/l[9]。

1.3 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定及分析

根據(jù)下列公式分別計(jì)算特定生長(zhǎng)率、相對(duì)增重率、肥滿度。

特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)=(Ln Wt-Ln W0)/t×100

相對(duì)增重率(RW，%)=(Wt-W0)/W0×100

肥滿度（K，g/cm3）=Wt/Lt3×100

式中：W0——實(shí)驗(yàn)開始前的初始體重(g)；

Wt——實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的終末體重(g)；

Lt——實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的終末體長(zhǎng)(cm)；

t——養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間(d)。

1.4 腸道菌群的采集及分析

1.4.1 實(shí)驗(yàn)魚腸道樣品的采集

本實(shí)驗(yàn)于第30 d 和第60 d 進(jìn)行腸道樣品的采集。采集開始前，停食24 h，確保寶石鱸腸道菌群的穩(wěn)定。每個(gè)處理組采樣10尾魚。先用75%的酒精棉球擦洗魚體體表，用消毒后的剪刀打開腹腔，剔除腸道附近的脂肪組織，用無(wú)菌水擦洗腸壁，剪下腸道并置于無(wú)菌離心管中。將樣品編號(hào)并登記，置于便攜式液氮罐中保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，保存于-80℃冰箱直至處理。

1.4.2 腸道樣品的處理及送檢

每個(gè)處理組隨機(jī)取5個(gè)腸道樣品混合，去除樣品的個(gè)體差異性，混合后新樣品置于新的無(wú)菌離心管中，每個(gè)處理組混合后樣品數(shù)為2，重新編號(hào)并登記（第60 d 采集的Control 組由于保存不當(dāng)只有1 個(gè)樣品）。將處理后樣品送至深圳華大基因進(jìn)行16S rD?NA測(cè)序。

1.4.3 生物信息學(xué)分析

將測(cè)序得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，濾除低質(zhì)量的reads，剩余高質(zhì)量的Clean data方可用于后期分析[10]。通過軟件FLASH（v1.2.11），利用部分重疊關(guān)系將成對(duì)的reads 拼接成Tags[11]。利用軟件USEARCH（v7.0.1090）將拼接好的Tags 聚類為可操作的分類單元OUT（Operational Taxonomic Unit），聚類相似度為97%[12]；利用UCHIME（v4.2.40）將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)生的嵌合體從OTU代表序列中去除[13]；使用usearch_global方法將所有Tags 比對(duì)回OTU 代表序列，得到每個(gè)樣品在每個(gè)OTU的豐度統(tǒng)計(jì)表[14]。得到OUT代表序列后，通 過RDP classifer（v2.2）軟 件 將OTU 代 表 序 列 與Greengene 數(shù)據(jù)庫(kù)有比對(duì)進(jìn)行物種注釋，置信度閾值設(shè)置為0.8。

根據(jù)每個(gè)樣品OTU 的豐度文件，通過R（v3.1.1）語(yǔ)言中的VennDiagram包做出Venn圖；根據(jù)各樣品差異性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析并計(jì)算樣品間距離，以判斷各樣品物種組成的相似性。聚類分析通過QIIME（v1.80）軟件進(jìn)行，以R（v3.1.1）畫圖，聚類方法 為UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean）[15]；根據(jù)每個(gè)OTU在每個(gè)樣品的相對(duì)豐度信息進(jìn)行OTU 的PCA 分析，通過R（v3.1.1）語(yǔ)言中ade4 包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖；通過與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)OTU進(jìn)行物種分類并分別在綱和屬兩個(gè)分類等級(jí)對(duì)各個(gè)樣品作物種分析，將物種豐度低于0.5%的物種全部合并成Others。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)所有統(tǒng)計(jì)分析均采用軟件SPSS 22.0 進(jìn)行，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 酪酸菌對(duì)寶石鱸生長(zhǎng)性能的影響(見表2)

表2 不同濃度酪酸菌對(duì)寶石鱸生長(zhǎng)性能的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

如表2 所示，Diet 2 組的終體質(zhì)量和終體長(zhǎng)均顯著高于其它組（P＜0.05）。Diet 2組的相對(duì)增長(zhǎng)率高于其他組，且與Control 組、Diet 3 組均有顯著差異（P＜0.05）。四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的特定生長(zhǎng)率均沒有顯著差異（P＞0.05），但Diet 2 組的特定生長(zhǎng)率最高。Diet 1 組的肥滿度高于其他實(shí)驗(yàn)組，與Control 組有顯著差異（P＜0.05），與Diet 2組、Diet 3組沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.2 酪酸菌對(duì)寶石鱸腸道菌群的影響

2.2.1 寶石鱸腸道菌群Alpha多樣性分析

分別對(duì)不同腸道樣品的Alpha 多樣性指數(shù)進(jìn)行了計(jì)算（表3）。通過對(duì)比各樣品Alpha多樣性指數(shù)可知，相對(duì)于第30 d，在第60 d時(shí)除了Diet 1組，其他各組的Sobs指數(shù)和Chao 1指數(shù)均有所下降；Control組和Diet 2 組的Shannon 指數(shù)、Diet 1 組的Simpson 指數(shù)和Diet 3 組的Ace 指數(shù)均有所下降。并且在第60 d 時(shí)，Diet 1 組的Sobs 指數(shù)、Chao 1 指數(shù)、Ace 指數(shù)最大，Di?et3 組的Shannon 指數(shù)最大、Simpson 指數(shù)最小。由于Sobs 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Ace 指數(shù)、Shannon 指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品中的物種Alpha多樣性越高。因此在第60 d 時(shí)，Diet1 組和Diet3 組的Alpha 多樣性相對(duì)較高。

2.2.2 寶石鱸腸道菌群Beta多樣性分析

根據(jù)各樣品OTU 差異性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，以判斷各樣品物種組成的相似性(見圖1)。圖中相同顏色的樣品表示屬于同一采集時(shí)間，樣品越靠近，枝長(zhǎng)越短，說明兩個(gè)樣品的物種組成越相似。如圖1 所示，第30 d 采集的樣品聚為一支，再與B1H22聚為一大支，且這些樣品之間物種組成較為相似。剩余的第60 d采集的樣品聚為另一大支，且各樣品之間物種組成差異較大。

表3 不同腸道樣品的Alpha多樣性指數(shù)

為了進(jìn)一步揭示各樣品物種的分布情況，進(jìn)行了基于各樣品OTU數(shù)據(jù)的PCA主成分分析(見圖2)。寶石鱸腸道菌群OTU 水平的PCA 三維排序圖的第一軸（PC1）、第二軸（PC2）、第三軸（PC3）分別能解釋50%、25%和13%的物種變化信息。圖中各樣品間空間距離越近，說明其物種組成越相似。如圖2所示，第30 d所采集的樣品之間空間距離都十分相近，說明此時(shí)寶石鱸腸道菌群組成十分相似。而在第60 d時(shí)，各樣品分布較為離散，除了B1H22與第30 d所采集的樣品菌群組成較為相似，其他樣品均遠(yuǎn)離第30 d所采集的樣品。

圖1 寶石鱸腸道菌群OTU聚類分析圖

圖2 寶石鱸腸道菌群OTU水平的PCA三維排序圖

2.3 寶石鱸腸道菌群群落組成分析

2.3.1 綱水平上的群落組成分析

在綱的分類水平上，15個(gè)寶石鱸腸道樣品共檢測(cè)到17 個(gè)細(xì)菌綱。如圖3 所示，將相對(duì)豐度大于1%的綱定義為優(yōu)勢(shì)綱。寶石鱸腸道菌群共含有3 個(gè)優(yōu)勢(shì)綱，分別為芽孢桿菌綱（Bacilli）、Fusobacteriia 和梭菌綱（Clostridia）。在第30 d時(shí)，Control組最優(yōu)勢(shì)綱為芽孢桿菌綱，平均相對(duì)豐度達(dá)到96.91%。Diet組最優(yōu)勢(shì)綱為芽孢桿菌綱，平均相對(duì)豐度為96.14%；其次為Fusobacteriia，平均相對(duì)豐度為1.22%。而到第60 d時(shí)，Control組最優(yōu)勢(shì)綱為Fusobacteriia，平均相對(duì)豐度達(dá)到76.39%；其次為芽孢桿菌綱，平均相對(duì)豐度為13.37%；梭菌綱平均相對(duì)豐度為8.74%。Diet 組最優(yōu)勢(shì)綱為芽孢桿菌綱，平均相對(duì)豐度為52.48%；其次為Fusobacteriia，平均相對(duì)豐度為37.30%；梭菌綱，平均相對(duì)豐度為7.22%。

2.3.2 屬水平上的群落組成分析

在屬的分類水平上，15個(gè)寶石鱸腸道樣品共檢測(cè)到41 個(gè)細(xì)菌屬。如圖4 所示，將相對(duì)豐度大于1%的屬定義為優(yōu)勢(shì)屬。寶石鱸腸道菌群共含有5 個(gè)優(yōu)勢(shì)屬，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、鯨桿菌屬（Cetobac?terium）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、乳酸球菌屬（Lactococcus）和大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）。在第30 d 時(shí)，Control 組最優(yōu)勢(shì)屬為芽孢桿菌屬，平均相對(duì)豐度達(dá)到55.19%；其次為大洋芽孢桿菌屬，平均相對(duì)豐度為26.90%；乳酸球菌屬，平均相對(duì)豐度為9.87%；微小桿菌屬，平均相對(duì)豐度為1.36%。Diet 組最優(yōu)勢(shì)屬為芽孢桿菌屬，平均相對(duì)豐度為55.88%；其次為大洋芽孢桿菌屬，平均相對(duì)豐度為26.49%；乳酸球菌屬，平均相對(duì)豐度為9.14%；微小桿菌屬，平均相對(duì)豐度為1.24%；鯨桿菌屬，平均相對(duì)豐度為1.17%。而在第60 d 時(shí)，Control 組最優(yōu)勢(shì)屬為鯨桿菌屬，平均相對(duì)豐度達(dá)到76.38%；其次為芽孢桿菌屬，平均相對(duì)豐度為8.20%；大洋芽孢桿菌屬，平均相對(duì)豐度為3.55%；乳酸球菌屬，平均相對(duì)豐度為1.03%。Diet 組最優(yōu)勢(shì)屬為鯨桿菌屬，平均相對(duì)豐度為37.28%；其次為芽孢桿菌屬，平均相對(duì)豐度為31.85%；大洋芽孢桿菌屬，平均相對(duì)豐度為13.24%；乳酸球菌屬，平均相對(duì)豐度為4.81%。

3 討論

3.1 酪酸菌對(duì)寶石鱸生長(zhǎng)的影響

在喂養(yǎng)不同濃度的酪酸菌一段時(shí)間后，0～0.5%的酪酸菌添加范圍內(nèi)，寶石鱸的相對(duì)增長(zhǎng)率、特定生長(zhǎng)率隨著酪酸菌的濃度增加而增加，其中以0.5%的添加組顯著高于對(duì)照組。在1%的高濃度的添加比例中，寶石鱸的體重、相對(duì)增長(zhǎng)率、特定生長(zhǎng)率比0～0.5%的實(shí)驗(yàn)組相對(duì)減少。所以，適當(dāng)濃度的酪酸菌（0～0.5%）會(huì)促進(jìn)寶石鱸的生長(zhǎng)，提高其飼料的轉(zhuǎn)化率。但酪酸菌的添加比例過高了，通過與對(duì)照組對(duì)比，發(fā)現(xiàn)寶石鱸的生長(zhǎng)發(fā)育受到了抑制，其飼料轉(zhuǎn)化率降低。

在王騰浩[16]的研究中，酪酸菌可能通過分泌消化酶來(lái)輔助消化，從而提高飼料的轉(zhuǎn)化率。結(jié)合王愛民[17]、劉迎春[18]的研究可知：適當(dāng)濃度的外源酶可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育，提高其內(nèi)源酶對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解作用，提高生長(zhǎng)性能。而過高濃度的外源酶則反之。

圖3 寶石鱸腸道菌群綱分類水平相對(duì)豐度圖

圖4 澳洲寶石鱸腸道菌群屬分類水平相對(duì)豐度圖

3.2 酪酸菌對(duì)寶石鱸腸道菌群多樣性的影響

在喂養(yǎng)不同濃度的酪酸菌一段時(shí)間后，通過高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)第30、60 d 的腸道樣品進(jìn)行菌群多樣性分析，可以知道：隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，寶石鱸腸道菌群物種組成更加復(fù)雜更加多樣化。

3.3 酪酸菌對(duì)寶石鱸腸道菌群群落組成的影響

通過16S rDNA 測(cè)序技術(shù)與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在喂養(yǎng)不同濃度的酪酸菌一段時(shí)間后，Diet組的芽孢桿菌綱、Fusobacteriia 和梭菌綱的相對(duì)豐度遠(yuǎn)大于其他綱。

在屬的分類水平上，發(fā)現(xiàn)了隨著寶石鱸生長(zhǎng)的階段的不同，其優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生變化。隨著養(yǎng)殖時(shí)間的推移，其芽孢桿菌屬和大洋芽孢桿菌屬成為優(yōu)勢(shì)菌群。這與張振男等[19]研究結(jié)果相吻合,魚類的優(yōu)勢(shì)菌群可能隨著生長(zhǎng)階段的不同發(fā)生變化。

在屬的分類水平上，在0～0.5%的酪酸菌添加比例中，益生菌群（鯨桿菌屬、芽孢桿菌屬、海洋芽孢桿菌屬和乳球菌屬等）相對(duì)豐度隨著外源酪酸菌濃度增加而增加，條件致病菌如鄰單胞菌屬、擬桿菌屬、類芽孢桿菌屬、氣球菌屬、腸球菌屬等，其相對(duì)豐度隨著外源酪酸菌增加而減少。在1%的酪酸菌添加的實(shí)驗(yàn)組中，其益生菌群對(duì)比0.5%的實(shí)驗(yàn)組反而減少，其致病菌也增加。說明了適當(dāng)濃度的外源酪酸菌可以改變寶石鱸腸道菌群的結(jié)構(gòu)，提高其益生菌的比例，減少致病菌，提高魚體的免疫力。樊愛麗等[20]通過酪酸菌治療感染大腸桿菌的雞群，發(fā)現(xiàn)了酪酸菌可以通過提高乳酸菌和酪酸菌數(shù)量來(lái)提高機(jī)體的免疫力，從而減輕大腸桿菌對(duì)肝臟的損傷。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[21]，鯨桿菌屬可以通過產(chǎn)生維生素B12來(lái)提高魚類的營(yíng)養(yǎng)吸收能力。海洋芽孢桿菌屬[22]可以通過分泌多種生物活性物質(zhì)，具有高效的作用。酪酸菌[23]可以產(chǎn)生丁酸梭菌素，維持腸道益生菌群的平衡，抑制致病菌，從而提高機(jī)體的抗病性。益生菌群[24]可以通過分泌維生素B12、泛酸等物質(zhì)，提供腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

4 結(jié)論

飼料中添加酪酸菌能有效的改善寶石鱸腸道菌群，提高益生菌群的比例，降低了致病菌的含量，其中0.5%的酪酸菌添加量顯著提高了寶石鱸的生長(zhǎng)性能。