■李美發(fā) 陳作棟 梁 歡 柏 峻 趙二龍 易中華 瞿明仁 許蘭嬌

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省動物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗室飼料工程研究中心，江西南昌330045）

中草藥因其綠色、安全、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)勢，是一種前途遠(yuǎn)大的綠色飼料添加劑[1-2]。

從近些年的研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)于中草藥的體外抑菌試驗的報道有很多[3-5]。呂彪等[6]采用水煎煮法，對大黃、黃連和黃岑等20種中草藥的抑菌活性進(jìn)行分析，采用試管二倍稀釋法，測定中草藥對豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)，結(jié)果顯示，大黃、黃連對四種病原菌有良好的抑菌作用。向雙云等[7]，采用平板打孔法、牛津杯法和試管二倍稀釋法，檢測8種中草藥對大腸桿菌的抑制作用，結(jié)果表明：黃連、魚腥草、五味子、艾草對大腸桿菌的抑菌效果為高度敏感，五味子和艾草的最小抑菌濃度(MIC)為62.5 mg/ml，黃連和魚腥草的最小抑菌濃度(MIC)為125 mg/ml，大腸桿菌對其他4種中草藥均不敏感。中草藥的種類繁多，有效成分復(fù)雜，不同中草藥與不同菌種間的抑菌效果也存在很大差異。本研究旨在研究單一中草藥抑菌效果的基礎(chǔ)上，探討不同的中草藥組方對育肥豬大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果，為豬用復(fù)方添加劑生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃芪等八種中草藥購買于藥材市場。多種中草藥的復(fù)配組合以及黃芪、黃連、大黃的復(fù)配比例根據(jù)本實(shí)驗室前期研究確定。供試細(xì)菌為豬大腸桿菌、豬沙門氏菌、豬金黃色葡萄球菌，由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗室提供。

普通肉湯培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，加純化水至1 000 ml，pH值為7.2～7.4。

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，加純化水1 000 ml，pH值為7.2～7.4。

1.2 藥物制備

分別稱取中草藥10 g，按1∶10 比例加入100 ml蒸餾水，浸提24 h。浸提后轉(zhuǎn)移到超聲波震蕩器中，超聲20 min，使藥物中的有效成分充分溶解。再用文火加熱煮沸10 min，過濾后對藥渣進(jìn)行二次提取，合并兩次提取的藥液放入60 ℃的水浴鍋中濃縮。過濾、離心沉淀，最后濃縮至含生藥1 g/ml。

1.3 菌液培養(yǎng)

試驗前將大腸桿菌和沙門氏菌菌種接到普通肉湯培養(yǎng)基中復(fù)活，將復(fù)活的供試菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取典型菌落，接種于普通肉湯培養(yǎng)基，用滅菌生理鹽水稀釋，使其濁度達(dá)到1×105～1×109cfu/ml。

1.4 雙層瓊脂擴(kuò)散法

培養(yǎng)皿底層為15 ml 瓊脂培養(yǎng)基，待底層培養(yǎng)基凝固后，將10 μl金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的培養(yǎng)液分別與10 ml滅菌后在55 ℃的半固體瓊脂培養(yǎng)基混合均勻后，倒入鋪有下層培養(yǎng)基的平板上，待培養(yǎng)基凝固后放入牛津杯，每個牛津杯加入280 μl藥物試劑，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。抑菌圈直徑＞20 mm 為高度敏感，＞15 mm 且≤20 mm 為中度敏感，＞10 mm且≤15 mm為低度敏感，≤10 mm為不敏感。

1.5 微量二倍稀釋法

將兩種中草藥提取液用二倍稀釋法配成系列濃度的供試藥液。濃度梯度為1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.82、3.91、1.96 mg/ml。在試管中加入20 ml 菌液和20 ml 藥液，以無菌水作為對照，37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察各管細(xì)菌生長情況，其中渾濁帶有沉淀，說明有細(xì)菌生長，澄清透明說明該試管在相應(yīng)藥物濃度下對細(xì)菌生長有抑制作用。能抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度即為最小抑菌濃度。

1.6 復(fù)方中草藥的體外抑菌效果

單味中草藥所含的活性物質(zhì)較為單一，有很大的局限性，用它來預(yù)防和治療復(fù)雜的疾病，療效較差。中草藥復(fù)方的活性成分多，將多種中草藥合理地搭配起來，形成一個新的整體，發(fā)揮最大的功效。當(dāng)然，中草藥復(fù)方的成分較復(fù)雜，活性物質(zhì)難以分析，藥理作用研究難度大。在單一的中草藥體外抑菌試驗基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步研究復(fù)方中草藥的體外抑菌效果，采用黃芪∶何首烏按照1∶1、1∶3、3∶1；黃芪∶黃連∶大黃按照1∶1∶2、1∶2∶1、2∶1∶1 的比例進(jìn)行復(fù)配。通過體外抑菌實(shí)驗，研究中草藥組方對育肥豬腸道有害菌群的影響。

1.7 統(tǒng)計與分析

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理。

2 結(jié)果

2.1 八種中草藥對育肥豬腸道菌群藥敏效果的影響（見表1）

由表1 可知，中草藥濃度為1 g/ml 時，黃連、金銀花和五倍子對大腸桿菌呈高度敏感，抑菌圈直徑分別為24.54、20.13、20.13 mm，黃芪、大黃和白頭翁呈中度敏感，抑菌圈直徑分別為19.23、19.93、18.97 mm。首烏和葛根呈低度敏感，抑菌圈直徑均為10.7 mm。黃芪、黃連和大黃對金黃色葡萄球菌呈低度敏感，抑菌圈直徑分別為14.07、12.57、14.4 mm，其他中草藥無敏感性。黃連和大黃對沙門氏菌呈中度敏感，抑菌圈直徑分別為17.17 mm和18.13 mm，黃芪呈低度敏感，抑菌圈直徑為10.37 mm，其他中草藥無敏感性。

2.2 八種中草藥對育肥豬腸道菌群最小抑菌濃度的影響

2.2.1 八種中草藥對育肥豬大腸桿菌最小抑菌濃度的影響（見表2）

表2 八種中草藥對大腸桿菌最小抑菌濃度

由表2 可知，各中草藥對大腸桿菌均有一定的抑制效果，其中黃連和大黃效果最好，抑菌效果最強(qiáng)，MIC 值均為31.25 mg/ml，其次為首烏、金銀花、白頭翁和五倍子，MIC 值均為125 mg/ml，抑菌效果良好。黃芪和葛根，MIC值均為250 mg/ml，抑菌效果較差

2.2.2 八種中草藥對育肥豬金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度的影響（見表3）

表3 八種中草藥對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度

由表3可知，各中草藥對金黃色葡萄球菌抑制效果最好的是黃連和大黃，MIC 值均為125 mg/ml，其次為黃芪，MIC 值為250 mg/ml，抑菌效果一般。其他中草藥，抑菌效果較差。

2.2.3 八種中草藥對育肥豬沙門氏菌最小抑菌濃度的影響（見表4）

表4 八種中草藥對沙門氏菌最小抑菌濃度

由表4 可知，沙門氏菌對黃連和大黃抑制效果最好，MIC 值均為62.5 mg/ml，其次為黃芪，MIC 值為250 mg/ml，抑菌效果一般。其他中草藥，抑菌效果較差。

2.3 兩種中草藥對育肥豬腸道菌群藥敏效果的影響（見表5）

表5 黃芪和何首烏復(fù)配體外抑菌效果

由表5 可知，黃芪和何首烏混合試驗，黃芪0.75 mg/ml+何首烏0.25 mg/ml 效果最好，大腸桿菌抑菌圈直徑16.1 mm，呈中度敏感，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑11 mm，呈低度敏感，沙門氏菌抑菌圈直徑9.8 mm，呈不敏感。黃芪0.25 mg/ml+何首烏0.75 mg/ml 和黃芪0.50 mg/ml+何首烏0.50 mg/ml，對大腸桿菌呈低度敏感，對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均為不敏感。

2.4 三種中草藥對育肥豬腸道菌群藥敏效果的影響（見表6）

表6 黃芪、黃連和大黃復(fù)配體外抑菌效果

由表6可知，黃芪、黃連和大黃三種混合試驗，黃芪0.25 mg/ml+黃連0.5 mg/ml+大黃0.25 mg/ml 效果最好，大腸桿菌抑菌圈直徑15.4 mm，呈中度敏感，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑12.9 mm，呈低度敏感，沙門氏菌抑菌圈直徑12.8 mm，呈低度敏感。其他兩組藥劑對三種菌都呈低度敏感，抑菌效果一般。

3 討論

3.1 綜合八種中草藥對育肥豬大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌效果，黃芪、黃連和大黃三種中草藥效果最好，對三種菌群均有明顯抑制作用。本試驗中，大黃對大腸桿菌有中度抑制作用，與張賽奇等研究結(jié)果[8]一致，但岳云升等發(fā)現(xiàn)大黃對大腸桿菌幾乎無作用[9]。何首烏對金黃色葡萄球菌沒有抑制效果，與汪倩雯等[10]報道一致。不同研究人員對同一種中草藥的研究結(jié)果差異很大。陳希文等研究發(fā)現(xiàn)何首烏有中度抑制作用[11]，楊聞等將何首烏破碎，乙醇回流提取，超聲波輔助，其最終產(chǎn)物具有明顯抑菌功效[12]。黃芪對沙門氏菌有較弱的抑制作用，與李國旺等研究發(fā)現(xiàn)[13]相同，王寧等研究表明黃芪對常見的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有明顯的抑制作用[14]。中草藥的抗菌成分主要為黃酮、生物堿、揮發(fā)油等，中草藥體外抑菌能力與提取物成分和含量有關(guān)，其有效成分能破壞病原菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，影響細(xì)菌的代謝，同時也給機(jī)體提供營養(yǎng)，增強(qiáng)免疫器官機(jī)能。中草藥中的活性成分還可以減弱5-羥色胺和組胺的血管通透性，抑制細(xì)胞排出，從側(cè)面起到抑菌作用[15]。還有研究表明，中草藥中的活性成分能消除R質(zhì)粒[16]，抑制β-內(nèi)酰胺[17]，起到影響病原菌的耐藥性的作用。本試驗中抑菌圈的大小與相關(guān)研究存在一定差異，原因可能是中草藥的產(chǎn)地、提取工藝、菌種血清型不同和測定方法不同。

3.2 利用中草藥組方可以減輕毒副作用，增強(qiáng)藥效，應(yīng)用效果更好的優(yōu)點(diǎn)[18]。研究了2種組方對育肥豬3種腸道有害菌的體外抑菌效果，以黃芪、黃連和大黃的組方效果最好，黃連比例越高，抑菌效果越好。2個組方對3種有害菌都有一定的抑菌作用，但是效果沒有單一中草藥的效果好。主要原因是各單一中草藥抑菌效果存在差異，在體外抑菌試驗中，單一中草藥的單位體積有效成分多于在組方中的含量，混合后抑菌成分有所下降。用雙層瓊脂擴(kuò)散法時，組方中草藥的成分較單一中草藥復(fù)雜，相互作用會影響藥液在瓊脂上的擴(kuò)散，從而影響其在平板上的抑菌效果[19]，所以單一中草藥的抑菌效果比組方好。

4 結(jié)論

在本試驗條件下：①黃連、金銀花和五倍子對大腸桿菌抑菌效果較好。②黃芪、黃連和大黃對金黃色葡萄球菌抑菌效果較好。③黃連和大黃對沙門氏菌抑菌效果較好。④中草藥組方以黃芪0.25 mg/ml+黃連0.5 mg/ml+大黃0.25 mg/ml體外抑菌效果最好。同時通過本試驗，結(jié)合國內(nèi)，尤其是金銀花、黃連等中草藥的產(chǎn)量，以及中草藥的綠色、安全等多種優(yōu)勢，黃連、金銀花等中草藥在現(xiàn)在以及未來的替抗、保障動物健康以及動物食品的安全方面，會發(fā)揮越來越重要的作用。隨著技術(shù)的進(jìn)步，中草藥提取物的制備工藝日漸成熟，中草藥的應(yīng)用會更有針對性，金銀花、黃連等中草藥在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛，從而降低飼養(yǎng)成本，進(jìn)一步提高經(jīng)濟(jì)效益。