韓 晴，曹 珂，朱更瑞，方偉超，陳昌文，王新衛(wèi)，劉擴展，游雙紅，王力榮

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009；2.重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 401329)

桃(PrunuspersicaL. Batsch)是深受大眾喜愛的大宗果品之一，尤以溶質(zhì)型鮮食品種為主。桃果肉的質(zhì)地可分為溶質(zhì)、不溶質(zhì)、硬質(zhì)3種類型[1-2]。此外，根據(jù)桃果肉(中果皮)與核(內(nèi)果皮)的粘連程度又可以將桃分為離核和粘核2種類型[3]。研究發(fā)現(xiàn)，桃果實成熟過程中，果肉質(zhì)地變化(主要是硬度下降)的主要原因是相關(guān)水解酶降解細胞壁多糖和蛋白質(zhì)導(dǎo)致細胞壁結(jié)構(gòu)的改變[4]。在該過程中，涉及一系列的酶和調(diào)控因子，其中多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)起到關(guān)鍵作用[5]。在溶質(zhì)型桃果實中，PG活性及其基因PpPG的表達量均隨著果實的軟化而增加[6-7]，但在不溶質(zhì)桃中則維持在較低水平[8]。桃果實的溶質(zhì)及粘離核性狀受到2個串聯(lián)重復(fù)的PpPG基因控制，該基因座位于4號染色體[9-10]。

乙烯是植物五大激素之一，它在植物的種子萌發(fā)、葉片衰老、脫落到果實成熟等生長發(fā)育過程中都起著重要的調(diào)節(jié)作用[11]。桃果實的成熟軟化尤其是PG基因的表達即受到乙烯誘導(dǎo)，因此，溶質(zhì)型桃果實成熟過程中存在一個呼吸躍變[12-13]，測量其乙烯釋放量是鑒定溶質(zhì)型和硬質(zhì)型肉質(zhì)的一種方法[14]。乙烯的生物合成則受2個關(guān)鍵酶ACS(ACC合成酶)和ACO(ACC氧化酶)的調(diào)控[15]。在硬質(zhì)型桃中，PpACS1基因的表達始終處于較低的水平，而溶質(zhì)型果實中PpACS1基因的表達隨著果實的成熟表達量迅速上升[16]。研究者發(fā)現(xiàn)，乙烯的合成與生長素密切相關(guān)[17]。硬質(zhì)型桃不軟化的原因是其在成熟期IAA的合成受阻導(dǎo)致PpACS1轉(zhuǎn)錄受到抑制，乙烯不能正常釋放所致[18-19]。PpYUC11是調(diào)控桃果實成熟期 IAA合成的關(guān)鍵候選基因，導(dǎo)致了硬質(zhì)型和其他肉質(zhì)類型桃果實成熟期乙烯釋放的差異[14]。

08-9-106和08-9-107是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所桃資源課題組通過雜交發(fā)現(xiàn)的2個優(yōu)系，表現(xiàn)為果肉質(zhì)地較硬、掛樹期長。本研究以溶質(zhì)型桃大久保為對照，分析08-9-106和08-9-107桃果實成熟過程中果實硬度、中果皮和近核處果肉內(nèi)源乙烯及相關(guān)基因的表達變化，為探討桃果實成熟軟化進程的分子調(diào)控機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試材

以國家果樹種質(zhì)資源鄭州桃圃的大久保、08-9-106、08-9-107為試驗材料。3份種質(zhì)的桃果實發(fā)育時期基本一致，約為108 d，在鄭州地區(qū)7月中旬成熟。從果實第2次膨大期(約果實成熟前20 d)之后開始取樣，采樣時間分別為花后92 d(7月1日)、98 d(7月7日)、103 d(7月12日)和108 d(7月17日)。每次采摘10個大小和成熟度一致果實為試材，一部分樣品用于測定果實硬度，另一部分樣品進行果肉取樣，分別取中果皮和近核處果肉(靠近內(nèi)果皮0.5 cm)，迅速用液氮冷凍，-80 ℃保存提取RNA備用。

在花后不同時期，采集果實單層放置于敞口保鮮盒內(nèi)，密封，室溫25 ℃，相對濕度70%。每次取12個大小和成熟度一致、果形端正的果實削去外果皮，取中果皮和近核處果肉為試材用于乙烯的測定。

1.2 硬度測定

果實硬度測定采用浙江托普儀器有限公司生產(chǎn)的水果硬度計(GY-4-J)，每次選取3個果實，削去果實縫合線兩側(cè)中部果皮測定果實的去皮硬度，每個樣品重復(fù)3次。取平均值作為每個樣品的去皮硬度，單位kg/cm2。

1.3 中果皮和近核處果肉乙烯釋放速率的測定

取4～6個桃果實的中果皮果肉置于密閉容器中，室溫密封2 h后抽取上層氣體測定乙烯含量，每個處理重復(fù)2次，每個重復(fù)測3次。以單位鮮質(zhì)量的果肉在單位時間內(nèi)釋放的乙烯量表示中果皮果肉的乙烯釋放速率，單位為nL/(g·h)。乙烯釋放量的測定采用島津(日本)GC-2010型氣相色譜儀。氣相色譜工作條件為：色譜柱：Rtx-1701(30 m×0.25 mm)，柱溫為50 ℃，載氣為氮氣(N2)，檢測器(FID)溫度200 ℃；進樣口溫度200 ℃；氫氣流速40 mL/min，空氣流量400 mL/min，壓力100 kPa，尾吹氣流30 mL/min；柱流量3.0 mL/min，進樣體積500 μL，分流比20。

近核處果肉乙烯釋放速率的測定：取近核處的寬0.5 cm、厚0.5 cm、長3.0 cm大小的果肉，放入10 mL帶橡膠蓋的玻璃瓶中，密封室溫放置0.5 h，抽取0.5 mL氣體，用于乙烯含量檢測，每處理重復(fù)2次，其他步驟同中果皮的測定方法。

1.4 相關(guān)基因?qū)崟r熒光定量表達分析

桃中果皮和近核處果肉的RNA提取采用多糖多酚植物RNA提取試劑盒(華越洋，北京)的方法進行，提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，采用NANODROP 1000 核酸蛋白儀(美國)檢測其濃度。RNA的反轉(zhuǎn)錄采用東洋紡反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，東京)，操作均按各試劑盒的使用說明書進行，cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)桃已登錄序列采用NCBI中的Blast-primer程序分別設(shè)計Actin、PpACS1、PpACO1、PpYUC11、PpPG5個基因的特異引物序列(表1)，引物由金唯智(蘇州)生物科技有限公司合成。

熒光定量PCR反應(yīng)在LightCycler 480Ⅱ型實時熒光定量PCR儀中進行，采用SYBR GreenⅠMaster 試劑盒(Roche，瑞士)進行擴增，反應(yīng)總體積10 μL，包含100 ng cDNA 1 μL，2×Lightcycler 480 SYBR Green I Master 5 μL，1.0 μmol/L上下游引物各0.25 μL和無RNAase水3.5 μL。反應(yīng)程序為：預(yù)變性95 ℃，5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次。試驗結(jié)果用2-ΔΔCT公式分析計算[20]，以內(nèi)參基因Actin的表達量為標(biāo)準(zhǔn)計算目的基因的表達量。

表1 RT-PCR所用引物Tab.1 Sequences of the primers used for RT-PCR

1.5 數(shù)據(jù)分析與作圖

采用Excel進行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實肉質(zhì)及粘離核性狀表型評價

2.1.1 果實成熟后期中果皮果肉硬度的變化 由圖1-A可知，大久保桃果肉的硬度在成熟過程中迅速下降，硬度由花后92 d的11.53 kg/cm2下降至花后108 d的0.75 kg/cm2，下降幅度達到94%，果實軟化迅速；08-9-106果實硬度的下降趨勢與大久保類似，由花后92 d的11.44 kg/cm2下降至花后108 d的1.31 kg/cm2，下降幅度為89%；08-9-107在果實成熟過程中硬度下降幅度小，由花后92 d的11.97 kg/cm2下降至花后108 d的9.73 kg/cm2。

圖1-B中從左到右依次為大久保、08-9-106和08-9-107。The accession in Fig.1-B from left to right was Okubo，08-9-106 and 08-9-107，respectively.

2.1.2 果實成熟后期果核外觀 由圖1-B的直接觀察可知，大久保和08-9-106的桃果肉與果核分離，屬于離核類型；08-9-107的桃果肉與果核粘連，屬于粘核類型。結(jié)合3份種質(zhì)果實成熟期的果肉硬度和果實橫切面觀察，判定大久保和08-9-106屬于離核溶質(zhì)類型，08-9-107屬于粘核硬質(zhì)(或不溶質(zhì))類型。

2.2 相關(guān)基因表達分析驗證中果皮果肉硬度變化及粘離核性狀的形成

桃果實質(zhì)地的軟化以及粘離核性狀的形成主要是果肉組織細胞壁的結(jié)構(gòu)降解和成分改變造成的，涉及多種細胞壁降解酶和調(diào)控因子。為進一步從分子水平驗證3份桃種質(zhì)果肉硬度下降的原因，分析了桃果實成熟后期中果皮和近核處果肉PpPG基因的表達。

由于PpPG基因座存在2個高度相似的基因Ppa006839m和Ppa006857m，二者CDS序列僅存在5個SNP差異，因此本研究中設(shè)計了兼并引物，對這對PpPG基因進行了表達分析。由圖2-A可知，在中果皮果肉中，桃大久保和08-9-106的PpPG基因表達較高，但峰值出現(xiàn)的時間存在差異，大久保為花后98～103 d，而08-9-106為花后103 d。在果實成熟后期，桃08-9-107的中果皮果肉中PpPG基因的表達始終維持在較低的水平。由圖2-B可知，在近核果肉處，桃大久保和08-9-106的PpPG基因表達規(guī)律與其在中果皮果肉類似；而桃08-9-107近核果肉處的PpPG基因表達量依然較低。分析基因表達與表型的關(guān)系，證實PG基因的表達是導(dǎo)致3份種質(zhì)中果皮硬度變化和粘離核性狀形成的主要原因。

圖2 果實成熟過程中中果皮(A)和近核處果肉(B)PpPG基因的表達Fig.2 Expression of PpPG gene in mesocarp (A) and flesh near endocarp (B) during peach fruit ripening

2.3 乙烯釋放對中果皮果肉硬度和粘離核性狀的影響

PG基因的表達受到乙烯的誘導(dǎo)[14]，為了分析3份桃種質(zhì)果肉硬度變化及粘離性狀差異的原因，測定了桃果實成熟后期中果皮和近核處果肉的乙烯釋放速率(圖3)。由圖3-A可知，桃08-9-107中果皮果肉的乙烯釋放量在花后92～108 d維持在較低水平，乙烯釋放速率在0.54～7.22 nL/(g·h)變化。在2個溶質(zhì)桃類型中，大久保中果皮果肉在花后92～103 d緩慢釋放乙烯，之后乙烯釋放速率增大，到花后108 d乙烯釋放速率達到42.26 nL/(g·h)，是花后92 d的15.31倍；而另外一個溶質(zhì)桃08-9-106的中果皮果肉乙烯釋放速率卻維持在極低的水平，花后92～108 d在0.26～2.20 nL/(g·h)波動。該結(jié)果暗示，桃08-9-106中果皮果肉PG基因的表達變化和硬度的下降與其乙烯釋放無關(guān)。

由圖3-B可知，大久保近核處果肉花后92～108 d的乙烯釋放與中果皮類似，均在果實成熟期有明顯釋放，與其離核性狀是一致的。同期，桃08-9-106和08-9-107近核處果肉的乙烯釋放速率較低。鑒于后2份種質(zhì)分別為離核和粘核，因此，乙烯釋放可能同樣不是08-9-106近核處果肉PG基因表達變化和離核的原因。

綜上，將大久保歸為響應(yīng)乙烯的離核溶質(zhì)類型，08-9-107為響應(yīng)乙烯的粘核硬質(zhì)類型，而08-9-106則為不響應(yīng)乙烯的離核溶質(zhì)類型。

2.4 相關(guān)基因表達分析驗證果實乙烯釋放速率的變化

2.4.1 不同桃種質(zhì)中果皮和近核處果肉中PpACS1基因的表達 為了探究08-9-106桃果實成熟后期乙烯合成較低的原因，分析了乙烯生物合成的關(guān)鍵基因ACS的表達，結(jié)果表明，PpACS1在桃大久保的花后92～98 d的中果皮和近核處果肉中均有較高表達，接近成熟表達量快速下降(圖4)，基因表達峰值位于乙烯釋放峰值之前；而桃08-9-106和08-9-107在果實成熟后期的中果皮和近核處果肉中PpACS1表達量極低(圖4)，與其無明顯乙烯釋放一致(圖3)。

圖3 桃果實成熟過程中中果皮(A)和近核處果肉(B)乙烯釋放速率的變化Fig.3 Changes in ethylene production in mesocarp (A) and flesh near endocarp (B) during peach fruit ripening

圖4 桃果實成熟過程中中果皮(A)和近核處果肉(B)PpACS1基因的表達Fig.4 Expression of PpACS1 gene in mesocarp (A) and flesh near endocarp (B)during peach fruit ripening

2.4.2 不同桃種質(zhì)中果皮和近核處果肉中PpACO1基因的表達 ACO是調(diào)控乙烯生物合成的另外一個關(guān)鍵酶[21]。由圖5可知，基因PpACO1在桃大久保和08-9-106的花后103 d有表達峰值。然而，桃08-9-107在花后92～108 d同樣有一定程度的表達，整體維持在恒定的水平，且在大部分時期表達量高于大久保。在近核處果肉中，桃08-9-107的PpACO1基因表達在花后92～108 d持續(xù)升高，而同期桃大久保和08-9-106則表達量較低。結(jié)合3份桃種質(zhì)中果皮和近核處果肉乙烯的釋放可知，PpACO1基因的表達與乙烯的合成關(guān)系的相關(guān)性不強。

圖5 桃果實成熟過程中中果皮(A)和近核處果肉(B)PpACO1基因的表達Fig.5 Expression of PpACO1 gene in mesocarp (A) and flesh near endocarp (B)during peach fruit ripening

2.4.3 不同桃種質(zhì)中果皮和近核處果肉中PpYUC11基因的表達PpYUC11是生長素合成的關(guān)鍵基因，在桃中通過調(diào)控生長素的合成影響乙烯的釋放。由圖6-A可以看出，在桃大久保中果皮中檢測到高表達的PpYUC11基因，而該基因在另外2份種質(zhì)08-9-106和08-9-107中果皮表達量較低。而在近核處果肉中，PpYUC11基因在3份種質(zhì)中的表達均隨著果實成熟而增加，整體表現(xiàn)為大久保峰值最高，08-9-107上升速率較快，而08-9-106峰值出現(xiàn)最晚。綜上所述，在中果皮果肉中，PpYUC11基因的表達與乙烯釋放速率一致；而在近核處果肉中，PpYUC11基因的表達與乙烯合成無明顯相關(guān)。

圖6 桃果實成熟過程中中果皮(A)和近核處果肉(B)PpYUC11基因的表達Fig.6 Expression of PpYUC11 gene in mesocarp (A) and flesh near endocarp (B) during peach fruit ripening

3 結(jié)論與討論

溶質(zhì)型桃果實屬于典型的呼吸躍變型，成熟過程中伴隨著內(nèi)源乙烯的顯著增長，果肉硬度快速下降[22]。本研究分析了3份桃種質(zhì)果實成熟后期中果皮果肉硬度變化和粘離核性狀的形成，發(fā)現(xiàn)08-9-106中果皮果肉硬度在成熟后期迅速下降，這與其PpPG基因的高表達是一致的，因此將其歸為溶質(zhì)桃。然而，對乙烯釋放速率和乙烯合成相關(guān)基因的表達變化分析結(jié)果表明，PpPG基因不受乙烯的誘導(dǎo)，因此該種質(zhì)應(yīng)屬于不響應(yīng)乙烯的溶質(zhì)型桃，這與前人的結(jié)果存在較大差異[23]，有待后續(xù)研究。

PpACS1和PpACO1是桃乙烯合成的關(guān)鍵酶，而PpACS1是乙烯合成的關(guān)鍵限速酶，其表達對桃果實成熟過程中硬度的變化發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在桃大久保中果皮果肉中，PpACS1的表達量較高，且峰值出現(xiàn)在乙烯大量釋放之前，與前人研究結(jié)果[16]一致。然而，其PpACO1基因的表達量卻低于08-9-106，即該基因并不是本研究3份種質(zhì)乙烯合成的關(guān)鍵基因。過去報道硬質(zhì)桃在成熟時乙烯釋放量非常低，PpACS1不表達而PpACO1有較高表達量[24-25]，與本試驗結(jié)果一致。說明PpACS1是控制乙烯合成的主效基因[26]。

近年來的研究表明，PpYUC11基因可以通過調(diào)控生長素合成影響乙烯的釋放[7]，如Tatsuki等[24]研究發(fā)現(xiàn)，硬質(zhì)桃果實乙烯生物合成受阻的主要原因是PpACS1基因轉(zhuǎn)錄受抑制。進一步分析表明[27-28]，成熟期PpYUC11的不表達導(dǎo)致了IAA合成受阻，影響乙烯不能正常釋放。在本研究中，同樣發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)桃中果皮PpYUC11基因表達較高，與乙烯釋放速率相關(guān)。為此，本研究同時分析了其在近核處果肉中的表達變化，試圖揭示其與粘離核性狀形成的關(guān)系。然而發(fā)現(xiàn)在果實接近成熟期，乙烯釋放有顯著差異的大久保和08-9-107的PpYUC11基因表達卻存在明顯差異，因此，本研究認(rèn)為桃果實粘離核性狀的形成與乙烯釋放速率和PpACS1的表達有關(guān)，與PpACO1和PpYUC11無關(guān)。