王 萍，于月華，白玉翠，萬會娜，倪志勇

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

大豆(GlycinemaxL. Merr.)是中國重要的糧食作物之一，已有5 000 a栽培歷史，中國東北為主要產(chǎn)區(qū)，大豆中含有豐富且比較全面的營養(yǎng)素，是我國重要的含有高蛋白質(zhì)的農(nóng)作物。大豆不僅是世界上最初進(jìn)行轉(zhuǎn)基因大面積商業(yè)化種植的作物，而且也是種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物。目前，在培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)大豆新品種中，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為非常重要的技術(shù)手段[1]。隨著人們生活水平的不斷提高，中國對大豆的需求量持續(xù)增加。

F-box 基因廣泛存在于各種植物中，是植物最大的基因家族之一。最初由Kumar等[2]于1995年因發(fā)現(xiàn)存在于細(xì)胞周期蛋白Cyclin F而得名。大豆、玉米和鷹嘴豆分別含有 509，359，285 個 F-box 基因[3-5]，F(xiàn)-box蛋白作為SCF復(fù)合物的主要亞基，可以通過蛋白質(zhì)N末端的F-box基序與Skp1結(jié)合，該基序由40～50個氨基酸基序組成[6]。F-box基因在調(diào)節(jié)各種生命活動中具有重要作用，包括激素反應(yīng)、側(cè)根形成、衰老、花發(fā)育、自交不親和等，以及對非生物和生物脅迫的反應(yīng)[7-10]。例如，從小麥(TriticumaestivumL.)中分離出F-box基因TaFBA1發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)TaFBA1的轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性得到了改善[11]。DOR在擬南芥中編碼F-box蛋白，其在干旱脅迫下作為ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉的抑制劑起作用[12]。許媛等[13]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-box蛋白與植物的干旱脅迫、鹽堿脅迫、低溫脅迫、重金屬脅迫、抗病性相關(guān)。Unusual Floral Organs(UFO)是擬南芥中發(fā)現(xiàn)的第一個F-box蛋白，UFO是花分生組織特性和花器官發(fā)育所必需的[14-15]?；舳⒌萚16]發(fā)現(xiàn)谷子SiF-box18對干旱、高鹽和 ABA 等都有響應(yīng)，推測SiF-box18基因可能在非生物脅迫響應(yīng)中起重要的作用。于蘭芳等[17]對葡萄干旱轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)11個F-box基因受干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，并對干旱響應(yīng)最強(qiáng)烈的VvF-box5基因進(jìn)行了進(jìn)一步的鑒定發(fā)現(xiàn)VvF-box5與信號傳導(dǎo)、抗病相關(guān)。劉選明等[18]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-box蛋白 FOF2參與了逆境脅迫，不同非生物脅迫的處理中，F(xiàn)OF2的功能表現(xiàn)并不完全一致，表明 FOF2在植物抗逆境脅迫響應(yīng)中的多重性特征。

關(guān)于植物F-box基因的信息主要來自擬南芥的研究，而關(guān)于大豆F-box基因(GmFBXs)的知識非常有限。據(jù)筆者所知，雖然已經(jīng)在大豆中預(yù)測了數(shù)百種F-box基因，但只有2種，即GmCOI1和GmZTL3，已被克隆并在功能上表征。GmCOI1與AtCOI1具有高百分比同源性，可能參與茉莉酮酸途徑[19]。GmZTL3是AtZTL的同源物，參與光信號傳導(dǎo)[20]。本研究以栽培大豆Williams 82的基因?yàn)椴牧?，對Glyma08g11030基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并用Glyma08g11030基因的編碼區(qū)和HIS融合成功構(gòu)建了 His-Glyma08g11030融合表達(dá)載體，通過原核細(xì)胞從而使植物蛋白質(zhì)在其中可以有效表達(dá)，以期為Glyma08g11030蛋白質(zhì)的功能研究和表達(dá)水平檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選取的大豆品種是Williams 82，該品種是新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院獲得的。本研究中所用到的pET28a原核表達(dá)載體是前期保存的。限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購于Fermentas公司；TaqDNA聚合酶購于北京全式金生物有限公司；大腸桿菌菌株(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備；引物合成由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1Glyma08g11030基因生物信息學(xué)分析 對Glyma08g11030序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，使用NCBI查找Glyma08g11030的開放閱讀框(ORF)及其編碼的氨基酸序列。從GenBank上下載其他物種的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比較；通過MEGA 4.1軟件構(gòu)建Glyma08g11030和其他物種的系統(tǒng)發(fā)生樹。用ExPASy(http：//www. expasy.org/tools/protparam)在線工具，預(yù)測Glyma08g11030蛋白的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及其理化性質(zhì)；利用 Phytozome V 10.3在線數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了Glyma08g11030基因在染色體上的定位。使用 SWISS-MODEL(http：//swiss model.expasy.org/)進(jìn)行蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬。

1.2.2 pET28a-Glyma08g11030原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)大豆Glyma08g11030基因的序列，設(shè)計(jì)帶有正向BamH Ⅰ和反向SacⅠ酶切位點(diǎn)的引物，Glyma08g11030-28-F：5′-AATGGATCCATGGAAGAA

GAAGAAGAAGGGCTTG-3′和Glyma08g11030-28-R：5′-TTTGAGCTCTCAAGCCATTGCAGTGAGGC-3′(引物中下劃線表示酶切位點(diǎn))，按照TransStart-Taq(北京，TransGen)推薦的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR，擴(kuò)增Glyma08g11030的ORF序列。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后，進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物亞克隆到含有HIS 標(biāo)簽的 PET-28a 原核表達(dá)載體上，經(jīng)過菌液 PCR檢測后，提取質(zhì)粒進(jìn)行檢測，并送上海美季生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析 將構(gòu)建成功的pET28a-Glyma08g11030菌株在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃ 180 r/min 進(jìn)行過夜培養(yǎng)，之后按照1∶100的比例用LB液體培養(yǎng)基稀釋菌液，并將菌液培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6左右時，分別用濃度為0，0.5，1.0，1.5 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)6 h后收集菌液。菌體樣品加入50 μL 2×上樣緩沖液和50 μL ddH2O，沸水浴10 min，冰上冷卻后，取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE(5%濃縮膠，12%分離膠)，分析蛋白表達(dá)結(jié)果，確定蛋白表達(dá)的最適IPTG誘導(dǎo)濃度。同樣，用最適IPTG誘導(dǎo)濃度1.0 mmol/L的IPTG，37 ℃培養(yǎng)0，2，4，6 h后收集菌液。以未加IPTG誘導(dǎo)的重組菌液，誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)pET28a空載體菌液作為對照，進(jìn)行SDS-PAGE分析[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Glyma08g11030基因結(jié)構(gòu)及序列分析

通過對Glyma08g11030序列的生物信息學(xué)分析，Glyma08g11030cDNA全長1 419 bp，開放閱讀框長1 362 bp，編碼453個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為51.288 ku，等電點(diǎn)為8.14。Glyma08g11030基因組DNA長度為 3 878 bp，使用GSDS 2.0在線軟件分析Glyma08g11030基因的結(jié)構(gòu)，通過分析發(fā)現(xiàn)該基因中包含2個外顯子和1個內(nèi)含子(圖1-A)。Glyma08g11030蛋白包含1個F-BOX保守域，該結(jié)構(gòu)域位于第106-147個氨基酸(圖1-B)。該基因定位于大豆第8號染色體Chr08：8063060..8066966(forward)。

A.Glyma08g11030結(jié)構(gòu)示意圖;B.Glyma08g11030保守結(jié)構(gòu)域示意圖。A.Schematic diagram of Glyma08g11030; B.Schematic diagram of Glyma08g11030 conserved domain.

2.2 Glyma08g11030進(jìn)化樹及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

本研究通過與木豆CaF-box、菜豆PHAVU、花生AiF-box、豇豆ViF-box、紅小豆VaF-box的氨基酸序列進(jìn)行比對和保守結(jié)構(gòu)域分析，大豆Glyma08g11030含有 F-BOX保守域，這也是此家族氨基酸序列的共性(圖 2)；將利用NCBI搜索得到的木豆、菜豆、花生、豇豆、紅小豆的氨基酸序列與Glyma08g11030的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對并作系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)Glyma08g11030與木豆CaF-box(Cajanuscajan，XP 020229814.1)聚在一個分支，親緣關(guān)系較近，氨基酸一致性為86%(圖3)。并通過SWISS-Model(http://swissmodel.expasy.org/)對Glyma08g11030蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，得到了該蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(圖4)。

2.3 Glyma08g11030基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

本試驗(yàn)利用PCR的方法擴(kuò)增了Glyma08g11030基因的保守域，并將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用試劑盒純化回收，回收產(chǎn)物經(jīng)過酶切檢測，并連接到PET28a原核表達(dá)載體中，從而得到了pET28a-Glyma08g11030重組質(zhì)粒。同時，對獲得的重組質(zhì)粒利用PCR的方法擴(kuò)增得到了1段特異性條帶，經(jīng)過電泳檢測分析發(fā)現(xiàn)該條帶長約1 362 bp(圖5)；并且通過測序結(jié)果比對分析，發(fā)現(xiàn)連入PET28a載體中的Glyma08g11030基因的保守域序列沒有發(fā)生堿基變化，表明獲得了正確的pET28a-Glyma08g11030原核表達(dá)載體。

圖2 大豆Glyma08g11030蛋白與其他植物蛋白的同源性比對Fig.2 Homology alignment of soybean Glyma08g11030 protein with other plant proteins

圖3 Glyma08g11030蛋白與其他蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Evolutionary tree analysis of Glyma08g11030 protein and other protein systems

2.4 Glyma08g11030基因在大腸桿菌中的表達(dá)及可溶性分析

本研究為了明確 pET28a-Glyma08g11030融合蛋白是否為可溶性蛋白，通過IPTG 終濃度為0，0.5，1.0，1.5 mmol/L，37 ℃ 分別誘導(dǎo) 6 h 后收集菌液，分離蛋白上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4個不同濃度 IPTG 誘導(dǎo)下，均能誘導(dǎo)出大小約為 45 ku的 His-Glyma08g11030 融合蛋白。同時，用 1.0 mmol/L，37 ℃ 分別誘導(dǎo) 0，2，4，6 h 后收集菌液，SDS-PAGE 電泳分析表明，誘導(dǎo) 6 h 蛋白表達(dá)量最大(圖6)，說明 pET28a-Glyma08g11030融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時以包涵體形式存在。

圖4 大豆Glyma08g11030蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of the tertiary structure of soybean Glyma08g11030 protein

M.DNA DL2000 Marker;1-6.pET28a-Glyma08g11030重組質(zhì)粒菌液PCR檢測;7.水對照。M.DNA DL2000 Marker; 1-6.pET28a-Glyma08g11030recombinant plasmid bacterial solution PCR; 7.Water control.

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 Marker; 1-4.pET28a-Glyma08g11030經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，IPTG誘導(dǎo)終濃度分別為0，0.5，1.0，1.5 mmol/L; 5-8.pET28a-Glyma08g11030經(jīng)1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo) 0，2，4，6 h。M.Protein molecular weight Marker; 1-4.pET28a-Glyma08g11030 induced by IPTG，the final concentration of IPTG induction is 0，0.5，1.0，1.5 mmol/L;5-8.pET28a-Glyma08g11030 1.0 mmol/L IPTG induced 0，2，4，6 h.

3 結(jié)論與討論

F-box蛋白是一個龐大的蛋白家族，在過去的幾十年中，已經(jīng)在真核生物中鑒定了許多F-box蛋白[22-23]。在植物中，F(xiàn)-box蛋白家族也是最大和最多樣化的基因家族之一。F-box蛋白在其N-末端含有至少1個保守的F-box基序，其與SKP1相互作用以形成SCF復(fù)合物。它們的C-末端通常由1個或幾個蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域組成，用于特異性底物結(jié)合。F-box基因不僅參與信號傳導(dǎo)等生命活動，還介導(dǎo)干旱等非生物脅迫響應(yīng)[24]。然而，大多數(shù)植物F-box基因的功能仍然未知，特別是在大豆中。Jia等[25]經(jīng)過研究，在新版本的大豆基因組數(shù)據(jù)庫Wm82.a2.v1中鑒定了509個F-box基因，發(fā)現(xiàn)GmFBX列表與之前的研究基本相同[26]，并根據(jù)大豆基因組數(shù)據(jù)庫的更新進(jìn)行更新?；舳⒌萚16]研究發(fā)現(xiàn)，19個F-box基因?qū)Ω珊得{迫的響應(yīng)主要通過MYB和MYC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。F-box蛋白介導(dǎo)了植物對逆境脅迫的應(yīng)答響應(yīng)，對植物正常生長發(fā)育至關(guān)重要。陳秀秀等[27]對部分F-box蛋白序列通過分析驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)F-box蛋白在一些非生物脅迫，如干旱、熱激、ABA等脅迫中表達(dá)量會發(fā)生相應(yīng)的變化。Chen等[28]研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜CsTIR/AFB基因中含有 F-box 結(jié)構(gòu)域，通過異位表達(dá)可以提高擬南芥的耐鹽性。An等[29]發(fā)現(xiàn)，MAX2是一種多功能的 F-box蛋白，過表達(dá)Md MAX2能夠提高植株的耐鹽和耐旱性。

一些F-box蛋白參與植物激素信號傳導(dǎo)和對生物脅迫的反應(yīng)[30-32]。Kim等[33]通過對miR394a/b的研究發(fā)現(xiàn)，miR394a/b是保守的小RNA，它可以通過抑制F-box 蛋白LCR的表達(dá)，從而影響 ABA 途徑，調(diào)控植物抗旱、抗鹽性。擬南芥F-box蛋白AtFBP7是溫度脅迫期間有效翻譯所必需的[34]。一些研究表明，幾種F-box蛋白基因的表達(dá)受非生物脅迫的調(diào)節(jié)，Jain等[3]發(fā)現(xiàn)水稻中23種F-box蛋白的表達(dá)在鹽脅迫中上調(diào)或下調(diào)。F-box蛋白CarF-box1也被鷹嘴豆的鹽和干旱脅迫上調(diào)[35]。Yan等[36]發(fā)現(xiàn)MAIF1基因的過表達(dá)降低了非生物脅迫耐受性并促進(jìn)了水稻的根系生長。然而，小麥RING泛素連接酶 TdRF1對細(xì)胞脫水具有保護(hù)作用[37]。

最近，F(xiàn)-box蛋白FBL17被鑒定為植物發(fā)育不同階段細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)因子[38]。對于大多數(shù)植物而言，種子萌發(fā)和早期幼苗生長對非生物脅迫高度敏感[39]。以前的研究還表明，F(xiàn)-box基因在種子萌發(fā)中起重要作用[18]。大豆F-box蛋白的生化特征和亞細(xì)胞定位差異很大。預(yù)計(jì)大多數(shù)大豆F-box蛋白質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞器中。預(yù)計(jì)會有一些細(xì)胞存在于質(zhì)膜、細(xì)胞外空間和液泡中。大部分大豆F-box蛋白被預(yù)測有多個亞細(xì)胞定位。報(bào)告顯示，測試的17種F-box蛋白中的大多數(shù)主要位于細(xì)胞內(nèi)區(qū)室和單個F-box蛋白可以在擬南芥中形成多個SCF復(fù)合物[6]。這些都表明，F(xiàn)-box蛋白在調(diào)節(jié)植物的生物過程中具有不同的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Glyma08g11030基因定位于大豆第8號染色體Chr08：8063060..8066966(forward)。

本研究利用RT-PCR的方法從大豆中克隆了Glyma08g11030基因。該基因cDNA全長1 419 bp，開放閱讀框長1 362 bp，編碼453個氨基酸。序列分析表明，Glyma08g11030基因組包含2個外顯子和1個內(nèi)含子。多序列比對結(jié)果表明，Glyma08g11030蛋白含有1個F-BOX保守域。并成功構(gòu)建了pET28a-Glyma08g11030原核表達(dá)載體。本研究為后續(xù)進(jìn)一步研究Glyma08g11030的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。