孫玉珺，吳 玥，馬德志，呂金瑩，賀韻涵，宮 磊，劉 哲，高麗丹，李 娜，閆 冬，朱晶桓，楊德光

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.齊齊哈爾市甘南縣扶貧開發(fā)服務(wù)中心，黑龍江 齊齊哈爾 162100)

玉米(ZeamaysL.)是世界廣泛種植的糧食作物，也是工業(yè)原料和動(dòng)物飼料的主要來源。作為一種嗜熱作物，玉米發(fā)芽的最佳溫度為25～28 ℃。黑龍江省種植的春玉米在苗期常遭受10 ℃以下、0 ℃以上的低溫冷害，低溫冷害(低溫和霜凍脅迫)是影響嗜熱作物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量最嚴(yán)重的環(huán)境脅迫之一[1-2]。低溫脅迫通常會(huì)導(dǎo)致植物的形態(tài)、生理生化和分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[3]。當(dāng)植物暴露在低于12 ℃的不凍溫度一段時(shí)間，且超過臨界期時(shí)，會(huì)發(fā)生一種被稱為“低溫?fù)p傷”的生理機(jī)能障礙[4-5]。然而，低溫傷害的癥狀主要包括生長(zhǎng)和光合能力下降、葉片壞死和變色、植株異常成熟和對(duì)疾病易感性的增加。

油菜素內(nèi)酯(Brassinolide，BR)，別名蕓苔素內(nèi)酯，是一類多羥基化的固醇類新型植物激素，在植物界廣泛存在。它們?cè)谥参锏募?xì)胞分裂、細(xì)胞伸長(zhǎng)、脈管分化、花粉管生長(zhǎng)、細(xì)胞衰老、基因調(diào)控、蛋白質(zhì)與核酸生物合成和光合作用[6-7]等多種植物活動(dòng)中具有不同的生理作用。一般來說，非生物脅迫可以引發(fā)植物體內(nèi)如過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧(1O2)等活性氧(ROS)物質(zhì)的積累，從而增加植物的氧化應(yīng)激反應(yīng)[8]；同時(shí)還可以增加植物的脯氨酸、甜菜堿、可溶性蛋白和可溶性糖含量[9-10]，從而增強(qiáng)植物體對(duì)脅迫反應(yīng)的抵抗能力。自從Hamada[11]首次報(bào)道油菜素內(nèi)酯對(duì)植物非生物脅迫有改善作用以來，許多研究人員對(duì)油菜素內(nèi)酯的作用進(jìn)行了研究。大多數(shù)研究都集中在緩解或減輕溫度或鹽度脅迫的損傷。例如，油菜素內(nèi)酯可以提高番茄[12]和水稻[13]的耐熱性；在低溫脅迫下油菜素內(nèi)酯也被證實(shí)對(duì)辣椒[14]和茄子[15]有積極的作用。在水稻中，油菜素內(nèi)酯增強(qiáng)了水稻幼苗抗低溫?fù)p傷能力，并在低溫條件下增加了水稻的株高、根長(zhǎng)、根生物量和總生物量[16]。李淑葉等[17]應(yīng)用2，4表油菜素內(nèi)酯可以顯著降低低溫脅迫下棉花葉片相對(duì)電導(dǎo)率，顯著提高光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率，增加了總?cè)~綠素的含量。

本研究中試驗(yàn)材料選取黑龍江省主栽玉米雜交品種天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)，在低溫(芽期6 ℃，苗期4 ℃)和常溫條件下，通過芽期浸種和苗期葉面噴施不同質(zhì)量濃度的油菜素內(nèi)酯溶液，研究不同質(zhì)量濃度的油菜素內(nèi)酯在低溫脅迫下分別對(duì)玉米發(fā)芽和幼苗生理特性的調(diào)控，探究油菜素內(nèi)酯不同濃度效應(yīng)對(duì)玉米發(fā)芽及幼苗抗冷性的影響，為玉米抗低溫逆境栽培提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與地點(diǎn)

供試品種為玉米雜交種天農(nóng)九號(hào)、天和1號(hào)，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；供試藥劑油菜素內(nèi)酯(Brassinolide)購自合肥博美生物科技公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年5月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院低溫人工氣候室盆栽進(jìn)行。

芽期：選擇飽滿且大小一致種子，每個(gè)重復(fù)選取30粒種子，3次重復(fù)，用0.5%次氯酸鈉(NaClO)溶液消毒種子3 min，然后用水沖洗3次，分別用質(zhì)量濃度為0(T0)，0.01(T1)，0.100(T2)，1.00 mg/L(T3)的油菜素內(nèi)酯浸種24 h，用蒸餾水(CK)作為常溫對(duì)照。轉(zhuǎn)入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)皿中水層深度為1 mm。低溫發(fā)芽溫度設(shè)置為6 ℃，常溫對(duì)照為25 ℃。黑暗條件下萌發(fā)，逐天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

苗期：選擇飽滿且大小一致種子，用0.5% NaClO溶液消毒種子3 min，然后用水沖洗3次，蒸餾水浸種24 h于培養(yǎng)缽(90 mm×100 mm)內(nèi)點(diǎn)播，土質(zhì)為草碳土。每個(gè)處理保苗200棵，3次重復(fù)。玉米幼苗培養(yǎng)至三葉一心期，在上午同一時(shí)間分別用質(zhì)量濃度為0(T0)，0.01(T1)，0.10(T2)，1.00 mg/L(T3)的油菜素內(nèi)酯進(jìn)行葉面噴施處理1次，每株噴施量相同，約為10 mL，用蒸餾水(CK)作為常溫對(duì)照。葉面噴施待常溫培養(yǎng)24 h后，低溫處理組放入4 ℃低溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d(Percival I-36VL美國，光強(qiáng)為100～560 μmol/(m2·s)，光照時(shí)數(shù)12 h，RH = 80%)。常溫對(duì)照處理(CK)轉(zhuǎn)入25 ℃ 培養(yǎng)箱正常生長(zhǎng)，其他設(shè)置與低溫處理組相同。低溫處理結(jié)束后取代表性植株測(cè)定生理生化指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.2 幼苗干鮮質(zhì)量、株高及根長(zhǎng)測(cè)量 低溫處理后立即取同位展開葉測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。隨機(jī)選取5株幼苗，用刻度為1 mm的直尺測(cè)量株高和根長(zhǎng)，算取5株平均值；用精度為0.001的電子天平(JA2603B型，上海精密科學(xué)儀器有限公司，中國)準(zhǔn)確稱量植株地上部和地下部鮮質(zhì)量；植株置于烘干箱105 ℃殺青30 min后，置于80 ℃下烘至恒質(zhì)量測(cè)定樣品干質(zhì)量。

1.3.3 生理指標(biāo)測(cè)定 SPAD值于上午09：00-12：00利用葉綠素計(jì)SPAD-520Plus，選取距離生長(zhǎng)點(diǎn)第2片完全展開葉，進(jìn)行SPAD值測(cè)定，每片葉片選取上、中、下分別讀數(shù)取平均值，每個(gè)處理重復(fù)3次。

相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)量，采用Mmettler Toledo FE30電導(dǎo)率儀進(jìn)行測(cè)定，取新鮮葉，用蒸餾水洗凈吸干水分，用葉片打孔器打成小片狀，放入100 mL三角瓶中，加入20 mL蒸餾水，室溫放置24 h后測(cè)定電導(dǎo)率L1，隨后轉(zhuǎn)入水浴鍋中沸水浴20 min，冷卻至室溫后測(cè)定電導(dǎo)率L2。相對(duì)電導(dǎo)率=L1/L2×100%。

丙二醛(MDA)含量(以鮮質(zhì)量計(jì))采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定[18]，稱取葉片0.5 g，加TCA冰浴研磨至勻漿，離心取上清液加入TBA，混勻后在沸水浴中煮沸，冷卻后離心。上清液利用分光光度計(jì)(PERSEE，中國北京)分別測(cè)定在450，532，600 nm處的OD值；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定[19]，反應(yīng)混合物包括磷酸鹽緩沖液(pH值7.8)、蛋氨酸、NBT、EDTA-Na2、酶提取液，4 000 lx照光后以空白調(diào)零，560 nm測(cè)量吸光值；過氧化物酶(POD)活性(以鮮質(zhì)量計(jì))采用愈創(chuàng)木酚混合液在470 mm下比色測(cè)定[20]；過氧化氫酶(CAT)活性(以鮮質(zhì)量計(jì))采用紫外吸收法測(cè)定[18]；采用酸性茚三酮法測(cè)定脯氨酸(Pro)含量(以鮮質(zhì)量計(jì))；采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白含量；采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel 2016作圖，SPSS 22 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)各項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，用 Duncan′s 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下不同質(zhì)量濃度BR浸種對(duì)玉米發(fā)芽的影響

由圖1可以看出，低溫脅迫明顯降低兩玉米種子的發(fā)芽率。使用不同質(zhì)量濃度的BR浸種處理，不同玉米品種的發(fā)芽率差異顯著。低溫脅迫下天農(nóng)九號(hào)在常溫CK處理中3 d全部發(fā)芽；在低溫脅迫下T0、T1和T3處理中第10天開始發(fā)芽，第24天結(jié)束發(fā)芽；各處理起始和結(jié)束發(fā)芽率分別為7.78%，13.33%，10.00%和93.33%，96.67%，98.89%。T2處理第10天開始發(fā)芽，第18天結(jié)束發(fā)芽，且起始和結(jié)束發(fā)芽率分別為26.67%和100.00%。天和1號(hào)在常溫CK處理中第3天開始發(fā)芽，第6天全部發(fā)芽；在低溫脅迫下T0、T1和T3處理中第10天開始發(fā)芽，第24天結(jié)束發(fā)芽；各處理起始和結(jié)束發(fā)芽率分別為8.89%，12.22%，14.44%和66.67%，60.00%，80.00%。T2處理第10天開始發(fā)芽，第24天結(jié)束發(fā)芽，且起始和結(jié)束發(fā)芽率分別為20.00%和85.56%。BR浸種處理可以明顯縮短低溫脅迫下玉米發(fā)芽時(shí)間，且T1、T2、T3浸種濃度明顯提高玉米種子低溫發(fā)芽率，其中T2濃度效果最好。天農(nóng)九號(hào)在T2濃度浸種處理下，起始和結(jié)束發(fā)芽率分別比常溫CK處理降低73.33，0百分點(diǎn)；比低溫T0處理增加18.89，6.67百分點(diǎn)。天和1號(hào)在T2濃度浸種處理下，起始和結(jié)束發(fā)芽率分別比常溫CK處理降低80.00，14.44百分點(diǎn)；比低溫T0處理增加11.10,18.89百分點(diǎn)。結(jié)果表明，在低溫脅迫下，T2處理為緩解低溫抑制種子發(fā)芽的最適濃度；其中天農(nóng)九號(hào)對(duì)低溫抵抗能力大于天和1號(hào)。

字母a、b、c、d表示各處理在0.05水平上差異顯著。圖2-6同。The letters a，b，c and d indicate that the treatment differs significantly at the 0.05 level. The same as Fig.2-6.

2.2 低溫脅迫下不同質(zhì)量濃度BR對(duì)玉米幼苗干鮮質(zhì)量、株高及根長(zhǎng)的影響

由表1可知，2個(gè)玉米品種在常溫(25 ℃)和低溫脅迫(4 ℃)處理下，經(jīng)3種不同濃度(T1、T2、T3)BR噴施處理后，玉米幼苗農(nóng)藝性狀變化明顯。低溫脅迫可以明顯降低玉米幼苗的株高、根長(zhǎng)和地上、下部干鮮質(zhì)量。低溫脅迫下，T1、T2、T3葉噴處理明顯緩解了低溫對(duì)幼苗的生長(zhǎng)抑制作用。低溫脅迫下兩玉米幼苗的株高明顯低于常溫CK處理，隨著噴施處理濃度的增加，幼苗株高呈先上升后下降的趨勢(shì)。兩品種幼苗株高均在T2處理時(shí)最高，株高分別為32.50，34.76 cm，分別比低溫T0處理增加20.07%，18.93%。低溫脅迫下兩玉米幼苗的根長(zhǎng)明顯低于常溫CK處理，隨著噴施處理濃度的增加，幼苗根長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)。兩品種幼苗根長(zhǎng)均在T2處理時(shí)最長(zhǎng)，根長(zhǎng)分別為26.30，32.83 cm，分別比低溫T0處理增加41.40%，64.15%。同樣的趨勢(shì)也在地上、下部干鮮質(zhì)量中被證實(shí)。天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)在T2處理時(shí)，地上部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別比低溫T0處理增加44.15%，55.92%和57.65%，49.15%；地下部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別比低溫T0處理增加32.04%，38.79%和49.87%，14.26%。結(jié)果表明，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，T2濃度為緩解低溫脅迫對(duì)幼苗農(nóng)藝性狀傷害的最適濃度，且不同品種間存在差異；該處理濃度對(duì)天農(nóng)九號(hào)地上部緩解能力大于天和1號(hào)，反之對(duì)天和1號(hào)地下部緩解能力大于天農(nóng)九號(hào)。

表1 不同質(zhì)量濃度BR對(duì)玉米幼苗干鮮質(zhì)量、株高及根長(zhǎng)的影響Tab.1 The effects of different concentrations of brassinolide on dry weight，fresh weight， plant height and root length of maize seedlings

注：同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示在5%水平上差異顯著。

Note：Different lowercase letters in each column means significant difference at 0.05 level.

2.3 低溫脅迫下不同質(zhì)量濃度BR對(duì)玉米幼苗SPAD值的影響

光合作用是植物生長(zhǎng)和有機(jī)物積累的主要過程，葉綠素含量是評(píng)估光合能力的標(biāo)準(zhǔn)，而SPAD值可以直觀地反映植物葉片的葉綠素含量。由圖2可知，兩玉米品種在低溫脅迫下，SPAD值顯著低于常溫CK處理。經(jīng)3種不同質(zhì)量濃度(T1、T2、T3)BR噴施處理后，可以明顯緩解低溫對(duì)玉米幼苗SPAD值的降低程度；隨著噴施濃度的增加，幼苗SPAD值呈先上升后下降的趨勢(shì)，且不同濃度的BR處理對(duì)兩品種SPAD值影響不同，其中T2處理時(shí)達(dá)到最大值。在低溫脅迫下，T0處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的SPAD值分別比常溫CK處理降低19.59%和21.74%，下降幅度天和1號(hào)>天農(nóng)九號(hào)；T2處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的SPAD值分別比低溫T0處理增加12.57%和18.88%。結(jié)果表明，噴施BR能夠明顯緩解低溫脅迫對(duì)玉米幼苗SPAD值的降低，T2處理濃度效果最好；且不同品種間存在差異，天和1號(hào)對(duì)低溫脅迫更敏感，低溫噴施BR處理后葉綠素緩解能力天和1號(hào)>天農(nóng)九號(hào)。

圖2 不同質(zhì)量濃度BR對(duì)幼苗SPAD的影響

2.4 低溫脅迫下不同質(zhì)量濃度BR對(duì)玉米幼苗相對(duì)電導(dǎo)率的影響

植物在低溫脅迫下，通常細(xì)胞膜最先接觸脅迫環(huán)境，相對(duì)電導(dǎo)率的高低可以直接反映植物細(xì)胞膜的損傷程度。不同質(zhì)量濃度BR處理對(duì)低溫脅迫下玉米幼苗相對(duì)電導(dǎo)率的影響如圖3所示。在低溫脅迫下，兩玉米品種葉片相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于常溫CK處理。經(jīng)3種不同質(zhì)量濃度(T1、T2、T3)BR噴施處理后，可以明顯降低低溫脅迫下玉米幼苗相對(duì)電導(dǎo)率；隨著BR噴施濃度的增加，幼苗相對(duì)電導(dǎo)率呈單峰曲線先降后升的趨勢(shì)，其中T2處理時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)到最小值。在低溫脅迫下，T0處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的相對(duì)電導(dǎo)率分別比常溫CK處理升高8.58%和9.54%，上升幅度天和1號(hào)>天農(nóng)九號(hào)；T2處理較T0處理相對(duì)電導(dǎo)率降低，天農(nóng)九號(hào)降低7.33%，天和1號(hào)降低6.80%。結(jié)果表明，低溫BR噴施能夠顯著緩解玉米幼苗相對(duì)電導(dǎo)率升高，T2處理濃度效果最好；不同品種間存在差異，天和1號(hào)對(duì)低溫脅迫更敏感，低溫噴施BR處理后相對(duì)電導(dǎo)率緩解能力天農(nóng)九號(hào)>天和1號(hào)。

圖3 不同質(zhì)量濃度BR對(duì)幼苗相對(duì)電導(dǎo)率影響Fig.3 The effects of different concentrations of brassinolide on relative conductivity

2.5 低溫脅迫下不同質(zhì)量濃度BR對(duì)玉米幼苗MDA含量的影響

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，ROS的損傷程度與MDA含量的高低有密切關(guān)系，因此，MDA是氧化脅迫的重要參數(shù)。由圖4可知，在低溫脅迫下，兩玉米品種葉片中MDA含量(以鮮質(zhì)量計(jì))高于常溫CK處理。經(jīng)3種不同質(zhì)量濃度(T1、T2、T3)BR噴施處理后，可以明顯緩解低溫對(duì)玉米幼苗MDA含量的增加程度；隨著BR噴施濃度的增加，幼苗MDA含量呈先降后升的趨勢(shì)，其中T2處理時(shí)MDA含量達(dá)到最小值。低溫脅迫下，T0處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的MDA含量分別比常溫CK處理升高234.04%和267.07%，上升幅度天和1號(hào)>天農(nóng)九號(hào)；T2處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的MDA含量分別比低溫T0處理降低35.31%和40.01%。結(jié)果表明，噴施BR能夠明顯緩解低溫脅迫對(duì)玉米幼苗MDA含量的升高，T2處理效果最好；不同品種間存在差異，低溫噴施BR處理后MDA緩解能力天和1號(hào)>天農(nóng)九號(hào)。

圖4 不同質(zhì)量濃度BR對(duì)幼苗MDA含量的影響

2.6 低溫脅迫下不同質(zhì)量濃度BR對(duì)玉米幼苗抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性的影響

當(dāng)植物暴露于低溫環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，抗氧化系統(tǒng)控制著ROS的水平并消除它們的不利影響。在該系統(tǒng)中，SOD、POD、CAT等抗氧化酶是脅迫階段最活躍最有效的保護(hù)機(jī)制，這些酶被認(rèn)為是指示生物和非生物脅迫的生物標(biāo)志物。

SOD催化超氧化物自由基歧化生成H2O2和O2，該酶被認(rèn)為是控制活性氧產(chǎn)生的第一道防線。從圖5-A可以看出，兩玉米品種在低溫脅迫下SOD活性(以鮮質(zhì)量計(jì))顯著高于常溫CK處理。經(jīng)3種不同質(zhì)量濃度(T1、T2、T3)BR噴施處理后，可以明顯增加低溫下玉米幼苗SOD的活性；隨著噴施濃度的增加，幼苗SOD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，且不同濃度的BR處理對(duì)兩品種SOD活性影響顯著，其中T2處理時(shí)SOD活性達(dá)到最大值。在低溫脅迫下，T0處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的SOD活性分別比常溫CK處理升高36.42%和52.39%，上升幅度天和1號(hào)>天農(nóng)九號(hào)；T2處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的SOD活性分別比低溫T0處理升高20.68%和35.99%。結(jié)果表明，噴施BR能夠明顯增加低溫脅迫下玉米幼苗SOD活性，T2處理濃度效果最好；不同品種間存在差異，天和1號(hào)對(duì)低溫脅迫更敏感，低溫噴施BR處理后SOD活性增加能力天和1號(hào)>天農(nóng)九號(hào)。

POD是一種雙功能酶，在標(biāo)準(zhǔn)過氧化物循環(huán)中，可以氧化H2O2等底物，POD可以通過各種分子催化還原H2O2，直接參與ROS的清除。如圖5-B所示，兩玉米品種在低溫脅迫下POD活性(以鮮質(zhì)量計(jì))顯著高于常溫CK處理。經(jīng)3種不同濃度(T1、T2、T3)BR噴施處理后，可以明顯增加低溫下玉米幼苗POD的活性；隨著噴施濃度的增加，幼苗POD活性呈單峰曲線先升后降趨勢(shì)，不同濃度的BR處理對(duì)兩品種POD活性影響顯著，其中T2處理時(shí)POD活性達(dá)到最大值。在低溫脅迫下，T0處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的POD活性分別比常溫CK處理升高35.97%和64.58%，上升幅度天和1號(hào)>天農(nóng)九號(hào)；T2處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的POD活性分別比低溫T0處理升高33.47%和46.28%。結(jié)果表明，噴施BR能夠明顯增加低溫脅迫下玉米幼苗POD活性，T2處理濃度效果最好；不同品種間存在差異，低溫噴施BR處理后POD活性增加能力天和1號(hào)>天農(nóng)九號(hào)。

CAT是含有四聚體血紅素的酶，具有直接將H2O2歧化為H2O和O2的潛力，CAT是所有酶中轉(zhuǎn)換率最高的抗氧化酶之一，1個(gè)CAT分子每分鐘可將600萬分子的H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，在脅迫條件下對(duì)于ROS的清除是必不可少的。如圖5-C所示，兩玉米品種在低溫脅迫下CAT活性高于常溫CK處理。經(jīng)3種不同濃度(T1、T2、T3)BR噴施處理后，可以明顯增加低溫下玉米幼苗CAT的活性；隨著噴施濃度的增加，幼苗CAT活性呈先升后降的趨勢(shì)，其中T2處理時(shí)CAT活性達(dá)到最大值。在低溫脅迫下，T0處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的CAT活性分別比常溫CK處理升高22.09%和19.23%，上升幅度天農(nóng)九號(hào)>天和1號(hào)；T2處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的CAT活性分別比低溫T0處理升高110.58%和120.43%。結(jié)果表明，噴施BR能夠明顯增加低溫脅迫下玉米幼苗CAT活性，T2處理度效果最好；不同品種間存在差異，低溫噴施濃BR處理后CAT活性增加能力天和1號(hào)>天農(nóng)九號(hào)。

圖5 不同質(zhì)量濃度BR對(duì)幼苗抗氧化酶活性的影響

以上結(jié)果表明，噴施BR能夠明顯增加低溫脅迫下玉米幼苗抗氧化酶活性，T2處理濃度為抗氧化酶提高的最適濃度；該濃度對(duì)3種抗氧化酶活性的提高幅度不同，分別為CAT活性>POD活性>SOD活性。

2.7 低溫脅迫下不同質(zhì)量濃度BR對(duì)玉米幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

低溫脅迫下植物會(huì)產(chǎn)生過量ROS，超過細(xì)胞的整體抗氧化潛能，導(dǎo)致氧化脅迫，對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響，因此，植物會(huì)積累大量如Pro、可溶性糖、可溶性蛋白等低分子質(zhì)量、高可溶性的有機(jī)化合物。這些化合物通常無毒，溶質(zhì)通過促進(jìn)細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)、解毒活性氧、保護(hù)膜的完整性和酶的穩(wěn)定性，進(jìn)而保護(hù)植物免受低溫脅迫的傷害。

Pro是一種氨基酸，其含量與植物脅迫之間存在正相關(guān)關(guān)系。它可以通過維持細(xì)胞膨脹或滲透平衡來賦予植物脅迫耐受性，從而穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)，防止電解質(zhì)泄漏，使活性氧的濃度在正常范圍內(nèi)，在植物脅迫中發(fā)揮著重要作用。如圖6-A所示，兩玉米品種在低溫脅迫下Pro含量高于常溫CK處理。經(jīng)3種不同質(zhì)量濃度(T1、T2、T3)BR噴施處理后，玉米幼苗中Pro的含量顯著增加；隨著噴施濃度的增加，幼苗中Pro含量呈先升后降的趨勢(shì)，不同濃度的BR處理對(duì)兩品種Pro含量影響顯著，其中T2處理時(shí)Pro含量達(dá)到最大值。在低溫脅迫下，T0處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的Pro含量分別比常溫CK處理升高8.17%和6.76%，上升幅度天農(nóng)九號(hào)>天和1號(hào)；T2處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的Pro含量分別比低溫T0處理升高66.59%和54.63%。結(jié)果表明，噴施BR能夠明顯增加低溫脅迫下玉米幼苗Pro含量，T2處理濃度效果最好；不同品種間存在差異，低溫噴施BR處理后Pro含量增加能力天農(nóng)九號(hào)>天和1號(hào)。

可溶性糖作為相容性的溶質(zhì)在植物抗低溫過程中起著關(guān)鍵作用。隨著低溫脅迫的進(jìn)行，植物體內(nèi)的可溶性糖會(huì)不斷累積，通過與脂質(zhì)相互作用，保護(hù)細(xì)胞膜免受脫水和低溫的傷害。如圖6-B所示，兩玉米品種在低溫脅迫下可溶性糖含量顯著高于常溫CK處理。經(jīng)3種不同質(zhì)量濃度(T1、T2、T3)BR噴施處理后，可增加低溫下玉米幼苗可溶性糖含量；隨著BR施用濃度增加，幼苗可溶性糖含量呈單峰曲線先升后降的趨勢(shì)，且兩品種不同濃度的BR處理可溶性糖含量變化顯著，其中T2處理時(shí)可溶性糖含量達(dá)到最大值。在低溫脅迫下，T0處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的可溶性糖含量分別比常溫CK處理升高15.98%和29.88%，上升幅度天和1號(hào)>天農(nóng)九號(hào)；T2處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的可溶性糖含量分別比低溫T0處理升高39.78%和58.51%。結(jié)果表明，低溫脅迫下噴施BR能夠顯著增加玉米幼苗可溶性糖含量，T2處理濃度效果最好；不同品種間存在差異，天和1號(hào)對(duì)低溫脅迫更敏感，低溫噴施BR處理后可溶性糖含量增加能力天和1號(hào)>天農(nóng)九號(hào)。

研究表明，可溶性蛋白的積累與植物冷凍或低溫脅迫的耐受性呈正相關(guān)，能參與維持細(xì)胞穩(wěn)定性。如圖6-C所示，兩玉米品種在低溫脅迫下可溶性蛋白含量顯著高于常溫CK處理。經(jīng)3種不同質(zhì)量濃度(T1、T2、T3)BR噴施處理后，可以增加低溫下玉米幼苗可溶性蛋白的含量；隨BR噴施濃度的增加，幼苗可溶性蛋白含量呈先升后降的趨勢(shì)，且不同濃度的BR處理對(duì)兩品種可溶性蛋白含量影響顯著，其中T2處理時(shí)可溶性蛋白含量達(dá)到最大值。在低溫脅迫下，T0處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的可溶性蛋白含量分別比常溫CK處理升高36.38%和18.97%，上升幅度天農(nóng)九號(hào)>天和1號(hào)；T2處理的天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)的可溶性蛋白含量分別比低溫T0處理升高33.52%和12.88%。結(jié)果表明，噴施BR能夠顯著增加低溫脅迫下玉米幼苗可溶性蛋白含量，T2處理濃度效果最好；不同品種間存在差異，低溫噴施BR處理后可溶性蛋白含量增加能力天農(nóng)九號(hào)>天和1號(hào)。

圖6 不同濃度BR對(duì)幼苗脯氨酸、 可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響Fig.6 The effects of different concentrations of brassinolide on proline and soluble sugar and soluble protein content

以上結(jié)果表明，噴施BR能夠明顯增加低溫脅迫下玉米幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，T2處理為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)提高的最適濃度；該質(zhì)量濃度對(duì)3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的提高幅度不同，分別為Pro含量>可溶性糖含量>可溶性蛋白含量。

3 結(jié)論與討論

玉米生長(zhǎng)的最佳溫度為25～28 ℃，適用于種子萌發(fā)、芽伸長(zhǎng)、葉片擴(kuò)張和干物質(zhì)積累等過程[21-24]。種子萌發(fā)和早期幼苗生長(zhǎng)是玉米對(duì)環(huán)境脅迫最敏感的階段[25]。低溫不利于玉米種子萌發(fā)和早期發(fā)育，明顯延長(zhǎng)種子萌發(fā)和出苗的平均時(shí)間，從而影響作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)，兩玉米品種經(jīng)低溫脅迫處理后，發(fā)芽時(shí)間明顯延長(zhǎng)，發(fā)芽率顯著降低，且不同品種發(fā)芽延長(zhǎng)時(shí)間差異顯著，這也和前人的研究結(jié)果相似[26-28]。經(jīng)不同質(zhì)量濃度的BR浸種處理后，可以明顯緩解低溫脅迫對(duì)兩玉米品種發(fā)芽的抑制作用，在馬金虎[29]的研究中也證實(shí)了這一點(diǎn)。本研究在試驗(yàn)范圍內(nèi)篩選出玉米低溫發(fā)芽的最適宜BR處理質(zhì)量濃度T2(0.1 mg/L)，該處理能顯著降低低溫脅迫對(duì)玉米發(fā)芽的抑制作用，T3處理優(yōu)于T1處理；T2處理的天農(nóng)九號(hào)在低溫脅迫下發(fā)芽提前6 d，天和1號(hào)沒有提前發(fā)芽，但明顯提高了終日發(fā)芽率，說明天農(nóng)九號(hào)比天和1號(hào)抗低溫發(fā)芽能力強(qiáng)。

低溫對(duì)植物的影響是多方面的，在植物幼苗生長(zhǎng)階段，低溫可導(dǎo)致復(fù)雜的細(xì)胞功能障礙癥狀，如萎蔫、生長(zhǎng)抑制、黃化甚至死亡。在生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段，不同組織對(duì)低溫的反應(yīng)有所不同。莖尖對(duì)低溫非常敏感，其會(huì)對(duì)葉片的質(zhì)量增長(zhǎng)以及生長(zhǎng)速度產(chǎn)生消極影響[30-31]。然而，在其他試驗(yàn)中，莖尖的低溫脅迫導(dǎo)致了葉片發(fā)育的延遲，但并沒有顯著影響光合作用的效率[32]。而葉片在低溫脅迫下抑制生長(zhǎng)現(xiàn)象似乎是由細(xì)胞周期持續(xù)時(shí)間的增加和幼苗在低溫脅迫下細(xì)胞數(shù)量的減少引起的[33]。徐曉昀等[34]研究表明，油菜素內(nèi)酯可以有效緩解低溫造成的黃瓜生物量的下降，可以明顯促進(jìn)干物質(zhì)的積累；劉巾瑞[35]通過試驗(yàn)證明，BR可以通過調(diào)節(jié)高粱的生理代謝，增強(qiáng)抵抗低溫脅迫的能力；同樣的結(jié)論也在甘薯、小麥、棉花等作物上得到證實(shí)[17，36-37]。本研究中發(fā)現(xiàn)，低溫明顯降低了兩玉米幼苗株高、根長(zhǎng)和地上、地下部干鮮質(zhì)量。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，葉面噴施3種(T1、T2、T3)質(zhì)量濃度的BR溶液能夠明顯改善低溫對(duì)玉米幼苗農(nóng)藝性狀的抑制現(xiàn)象，其中T2處理效果最顯著。馬金虎[29]的研究中也篩選出了試驗(yàn)范圍內(nèi)適宜低溫脅迫下玉米生長(zhǎng)的最適BR濃度。當(dāng)?shù)陀诨蚋哂赥2濃度時(shí)，不同品種的不同組織反應(yīng)不同。T1與T3處理相比，T1處理時(shí)，天農(nóng)九號(hào)的地上部和地下部生長(zhǎng)較好；而天和1號(hào)表現(xiàn)則不同，地上部和地下部均在T3濃度時(shí)生長(zhǎng)較好。這樣的現(xiàn)象說明不同品種對(duì)低溫脅迫和BR的適應(yīng)能力不同，對(duì)于冷敏感品種在≥最適濃度下噴施有利于植株幼苗生長(zhǎng)，而抗冷性較好的品種在≤最適濃度下噴施有利于植株幼苗生長(zhǎng)。

低溫脅迫已被公認(rèn)為植物生長(zhǎng)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的環(huán)境限制因素[38]。低溫?fù)p傷癥狀的發(fā)展，在某種程度上可能是由于植物體內(nèi)產(chǎn)生大量如超氧自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫和羥基自由基等活性氧物質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成損害[39]。Wang等[40]在研究中觀察到玉米幼苗在低溫脅迫時(shí)會(huì)明顯增強(qiáng)MDA的含量和質(zhì)膜的滲透性，這意味著玉米幼苗的膜結(jié)構(gòu)受損，溶質(zhì)和水在細(xì)胞內(nèi)很容易丟失，使細(xì)胞的含水量減少，導(dǎo)致幼苗嫩葉萎蔫。本研究發(fā)現(xiàn)，兩玉米品種經(jīng)低溫脅迫處理后，幼苗相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量顯著增加，但兩品種低溫脅迫時(shí)表現(xiàn)不同，抗低溫生長(zhǎng)能力天農(nóng)九號(hào)>天和1號(hào)。低溫脅迫下葉面噴施3種(T1、T2、T3)質(zhì)量濃度的BR溶液后，相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量有所下降，其中T2濃度處理效果最顯著。這也與劉巾瑞[35]發(fā)現(xiàn)BR噴施可以降低MDA含量和質(zhì)膜過氧化作的結(jié)果相一致。而本研究還發(fā)現(xiàn)，在T3濃度時(shí)天農(nóng)九號(hào)和天和1號(hào)相對(duì)電導(dǎo)率與最適T2處理差異不顯著；天農(nóng)九號(hào)在T3濃度時(shí)MDA含量與最適T2處理差異不顯著。

低溫脅迫還會(huì)直接影響光合器官，本質(zhì)上是通過影響光合作用的主要組件，包括類囊體電子傳遞受阻、脂質(zhì)過氧化破壞、碳水化合物積累和光合色素的損失[41]。低溫脅迫通過擾亂類囊體膜和光合色素從而影響光合作用裝置[42-43]。本研究中發(fā)現(xiàn)低溫脅迫噴施3種(T1、T2、T3)質(zhì)量濃度的BR溶液后，兩品種幼苗的葉綠素含量有所增加，其中T2處理葉綠素含量最高，但3種濃度處理間差異不顯著。說明低溫脅迫下葉綠素含量的下降不是抑制光合作用的主要因素。而BR是否對(duì)類囊體電子傳遞等過程起到調(diào)控作用目前未知。

為了清除活性氧的積累，減少細(xì)胞氧化損傷，植物必須刺激相應(yīng)的抗氧化防御系統(tǒng)，產(chǎn)生如POD、CAT、抗壞血酸過氧化物酶(APX)等酶類[44]和抗壞血酸、谷胱甘肽(GSH)[45-46]等一些非酶的抗氧化劑。Liu等[47]報(bào)道BR處理促進(jìn)高山離子芥植株中抗氧化酶的活性，增加了低溫脅迫下Pro和還原型谷胱甘肽的含量，從而清除了過量的ROS；國內(nèi)也有研究表明，適宜濃度的BR處理可以顯著提高草莓葉片的保護(hù)酶活性。同樣在本研究中也得到相同的結(jié)論，低溫噴施3種(T1、T2、T3)質(zhì)量濃度的BR溶液后，可以明顯升高低溫脅迫下抗氧化酶(SOD、POD、CAT)的活性，其中T2處理效果最顯著。而在本研究中還發(fā)現(xiàn)，T2濃度BR提高CAT活性的幅度大于其他2種保護(hù)酶，這可以印證前人提出的CAT為高效保護(hù)酶的觀點(diǎn)?？寡趸烙到y(tǒng)在植物抗低溫脅迫耐受能力中起著一定作用，同時(shí)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)也參與提高耐寒能力[48]。而另一類非酶的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如Pro、可溶性蛋白和可溶性糖等含量也會(huì)大量增加，從而緩解低溫脅迫對(duì)植物體造成的傷害。本研究低溫脅迫導(dǎo)致玉米幼苗Pro、可溶性糖和可溶性蛋白含量升高，BR噴施處理后提高了上述低溫脅迫下3種物質(zhì)的含量，其中Pro和可溶性蛋白含量上升顯著。

綜上所述，低溫脅迫顯著抑制不同玉米品種發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)，低溫下噴施油菜素內(nèi)酯可以緩解玉米在低溫脅迫下受到的損傷。不同質(zhì)量濃度的油菜素內(nèi)酯處理對(duì)玉米發(fā)芽率、農(nóng)藝性狀、葉綠素含量、抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均有顯著影響，0.1 mg/L BR處理?xiàng)l件下對(duì)玉米幼苗低溫脅迫的緩解效果最顯著。