劉英杰，蔣 悅，黃 國，王 寧，劉春峰，王天雪，李 婧，劉貴辰，隋曉楠，江連洲*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

蛋白質(zhì)是一種具有特定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子，含有20 種不同的氨基酸，是人體必需的重要營養(yǎng)成分之一。一直以來，人們?nèi)粘z入蛋白質(zhì)的來源主要是動物蛋白和植物蛋白。然而，近年來動物蛋白在人們膳食中的利用越來越受到研究學(xué)者們的質(zhì)疑，研究表明無論從環(huán)境保護(hù)、飲食可持續(xù)發(fā)展還是人類健康角度出發(fā)，人類飲食中植物蛋白代替動物蛋白都是一個明智的選擇[1-4]。大豆蛋白作為一種重要的全價蛋白，其成本低廉，營養(yǎng)豐富，是為數(shù)不多可替代動物蛋白的優(yōu)質(zhì)植物蛋白[5]。

除植物蛋白外，多酚類物質(zhì)也是人們?nèi)粘ｏ嬍持兄匾臓I養(yǎng)成分[6]。花青素是一種常見的水溶性類黃酮物質(zhì)，屬于多酚，其廣泛存在于蔬菜、水果、谷物及飲料等食物中，具有抗氧化、抗病菌、增強(qiáng)免疫力、抗炎癥的生理活性[7-10]。

多酚類物質(zhì)分子比較小，對蛋白具有天然的親和力，可與蛋白發(fā)生非共價（疏水相互作用、氫鍵、離子作用等）或共價互作。共價互作一般發(fā)生在堿性條件或多酚氧化酶存在條件下，多酚被氧化成醌后，可與蛋白多肽鏈上的氨基酸殘基生成穩(wěn)定的化學(xué)鍵（C—N/C—S鍵）進(jìn)而形成蛋白-多酚共價復(fù)合物。食品中蛋白與多酚的相互作用會不可避免的影響食品的口感，功能及吸收等特性[11-12]。因此，對蛋白與多酚互作的充分探究有益于實(shí)現(xiàn)蛋白在食品中的最大利用價值。

已經(jīng)有部分文獻(xiàn)對蛋白與多酚的共價互作進(jìn)行探究，例如牛血清白蛋白與槲皮素[13]、明膠與兒茶素[14-15]、牛血清白蛋白與兒茶素[16]、牛奶蛋白與類黃酮[17]、綠原酸與α-乳白蛋白[18]等。研究表明多酚對蛋白的共價交聯(lián)會影響蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及營養(yǎng)特性。但是不同種類的多酚對不同種類蛋白特性的影響有差異，且同一食品基質(zhì)中，多酚與蛋白的不同共價交聯(lián)方式也會不同程度地影響蛋白特性[19]。目前本課題組已經(jīng)對花青素與SPI在堿性條件下交聯(lián)的共價復(fù)合物進(jìn)行了部分結(jié)構(gòu)和功能的探究[7,20-21]，但是關(guān)于花青素與SPI共價復(fù)合物在人體消化中的功能性及營養(yǎng)性的研究尚存不足，兩者共價復(fù)合物的濃度與其分子結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)吸收特性的規(guī)律也沒有得到明確解析，花青素與SPI的不同共價交聯(lián)條件（堿性或多酚氧化酶）對其復(fù)合物相關(guān)性質(zhì)影響的探究更是留有空白。

由此，本實(shí)驗(yàn)選用不同質(zhì)量濃度的花青素與SPI分別在不同共價交聯(lián)條件（堿性或漆酶）下互作以形成花青素-SPI共價復(fù)合物，并將之進(jìn)行體外模擬胃腸消化，后用Caco-2細(xì)胞模型對其腸道消化產(chǎn)物進(jìn)行模擬人體小腸吸收，進(jìn)而探究花青素共價交聯(lián)后的SPI分子結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)吸收特性。本研究為花青素與SPI復(fù)合產(chǎn)品在食品中的合理應(yīng)用研究提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花青素黑米提取物 中國山西天之潤生物科技有限公司；大豆 市售；大豆分離蛋白由實(shí)驗(yàn)室自制；漆酶河北仟盛生物科技有限公司；豬膽鹽 北京索萊寶科技有限公司；甲酸、乙腈（均為色譜純）、胃蛋白酶（600 U/mg）、胰液素、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 美國Sigma公司；正己烷、乙酸乙酯、甲醇、鄰苯二甲醛（o-phthalaldhyde，OPA）、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸銨北京新光化工試劑廠；Caco-2細(xì)胞 美國ATCC生物生物標(biāo)準(zhǔn)品資源中心；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基 美國Gibco BRL公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-25MS超速高速冷凍離心機(jī) 上海盛析儀器設(shè)備有限公司；恒溫水浴振蕩搖床 常州恩培儀器制造有限公司；WAT023635高效液相色譜儀 美國Waters公司；Sunfire C18反向色譜柱（250 mm×4.6 mm）美國Waters公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海皖寧精密科學(xué)儀器有限公司；F-4500型熒光分光光度計 日本Hitachi公司；PHS-25型酸度計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Tecan Infinite 200 Pro酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

參考Wu Longkun等[22]的制備方法。將脫脂豆粉溶解于去離子水（1∶20（g/mL））后，用2 mol/L的NaOH溶液將混合溶液的pH值調(diào)節(jié)至8并攪拌2 h。將其懸浮液離心30 min（4 ℃、10 000×g）后取上清液，用2 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5后靜置1 h。將混合物離心20 min（4 ℃、6 000×g）得到蛋白沉淀，用去離子水水洗沉淀3 次后溶解，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH值中性，將此中性蛋白溶液冷凍干燥后即可得到SPI。

1.3.2 花青素的提純與定量

參考Sui Xiaonan等[23]的方法，將花青素黑米提取物按照1∶100（g/mL）比例溶解于去離子水中，減壓抽濾。收集濾液并對其進(jìn)行固相萃取，參考以下程序：將濾液、2 倍柱體積的酸化水、2 倍柱體積的乙酸乙酯溶液、4 倍柱體積酸化的甲醇溶液依次通過固相萃取柱。收集此花青素甲醇溶液，對其進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇后即可得到花青素純化物。花青素純化物在520 nm波長處用高效液相色譜進(jìn)行定量。梯度洗脫條件根據(jù)Sui Xiaonan等[23]的方法，流量為1 mL/min，溫度為25 ℃。同時本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一使用矢車菊素-3-葡萄糖苷（花青素黑米提取物中主要成分）質(zhì)量濃度為花青素質(zhì)量濃度。

1.3.3 花青素與SPI共價復(fù)合物的制備

參考Prigent等[18]的方法并稍作修改。將SPI粉末以1∶100（g/mL）比例溶解于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7）中，添加不同質(zhì)量濃度（0.17、0.25、0.5 g/L）的花青素后，加入漆酶（0.2 U/mL）避光攪拌24 h，并依次標(biāo)記為LC1、LC2、LC3。

參照Rohn等[24]的方法，將SPI粉末以1∶100（g/mL）比例溶解于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中，添加不同質(zhì)量濃度（0.17、0.25、0.5 g/L）的花青素后，調(diào)節(jié)溶液pH值至9.0后避光攪拌24 h，并依次標(biāo)記為AC1、AC2、AC3。將反應(yīng)后的6 組樣品透析48 h（截留分子質(zhì)量8～10 kDa），并隔8 h換水一次。凍干透析袋內(nèi)樣品后即可得花青素-SPI共價復(fù)合物。

1.3.4 三維熒光光譜分析

將SPI和花青素-SPI共價復(fù)合物溶解于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL。取樣品分別置于石英比色皿中測定。其中，以200 nm為起始激發(fā)波長，200～500 nm為連續(xù)掃描記錄發(fā)射波長；增長間隔10 nm，掃描曲線16 條。

1.3.5 體外模擬胃腸消化及消化產(chǎn)物水解度的測定

參考Minekus等[25]的方法稍作修改后對SPI及6 組共價復(fù)合物進(jìn)行體外模擬胃腸消化。將樣品分別溶于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其蛋白含量為50 mg/mL。取樣品溶液與模擬胃環(huán)境的電解質(zhì)溶液（6.9 mmol/L KCl、0.9 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3、47.2 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2·6H2O和0.5 mmol/L(NH4)2CO3）等體積混合后，加入0.3 mol/L CaCl2·2H2O。隨后添加一定質(zhì)量的胃蛋白酶（600 U/mg），使最終消化液中蛋白酶達(dá)2 000 U/mL，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)混合液pH值至3，上述樣品溶液及試劑在混合前均需在37 ℃條件下預(yù)熱30 min。將配制好的混合液置于水浴振蕩搖床中（37 ℃、170 r/min）進(jìn)行胃部消化反應(yīng)，2 h后用0.5 mol/L NaHCO3溶液將消化液pH值調(diào)至中性后結(jié)束胃部消化，期間實(shí)時監(jiān)控pH值為3。胃部消化反應(yīng)結(jié)束后取一定量的消化產(chǎn)物離心取上清液，進(jìn)行蛋白質(zhì)水解度測定。

取一定體積的胃部消化產(chǎn)物溶液與模擬腸部環(huán)境的電解質(zhì)溶液（6.8 mmol/L KCl、0.8 mmol/L KH2PO4、85 mmol/L NaHCO3、38.4 mmol/L NaCl和0.33 mmol/L MgCl2·6H2O）以1∶1的比例混合，加入0.3 mol/L CaCl2·2H2O和160 mmol/L的豬膽鹽。隨后添加一定質(zhì)量的胰液素，使最終消化液中胰蛋白酶達(dá)100 U/mL，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH值至7，將其置于水浴振蕩搖床中（37 ℃，170 r/min）進(jìn)行小腸消化反應(yīng)。模擬小腸消化過程中，分別于30、60、90、120、150 min和180 min處進(jìn)行抽樣檢測蛋白水解度，各消化終點(diǎn)處采用0 ℃冰浴30 min以結(jié)束小腸消化，期間實(shí)時監(jiān)控pH值為7。180 min反應(yīng)結(jié)束后的消化液高速離心取上清液，冷凍干燥得最終消化產(chǎn)物粉末。

1.3.6 蛋白水解度的測定

參考Nielsen等[26]的方法，取一定量的樣品溶于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其含量為10 mg/mL。然后取50 mg絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其濃度為0.951 6 meqv/L（式（1）），以此得到絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。將400 μL的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液、樣品溶液和PBS（空白）與3 mL OPA試劑混合，2 min后用可見光分光度計在340 nm波長處測定其吸光度。根據(jù)以下公式進(jìn)行水解度計算：

式中：Serine-NH2為每克蛋白絲氨酸氨基物質(zhì)的量/（mmol/g）；X為樣品質(zhì)量/g；P為樣品中的蛋白含量/%；0.1為樣品體積/L；α=0.97 meqv/g；β=0.342；htot=7.80；DH為水解度/%。

1.3.7 蛋白多肽濃度的測定

參考Zhu Chaozhi等[27]的方法。稱取80 mg OPA溶解于2 mL甲醇中，將其完全溶解后與50 mL四硼酸鈉（100 mmol/L）溶液，1 mL的β-巰基乙醇及5 mL，20%的十二烷基硫酸鈉溶液混合得到OPA試劑。隨后將最終消化產(chǎn)物粉末溶解于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其消化產(chǎn)物含量為0.5 mg/mL。取200 μL的消化產(chǎn)物溶液或梯度質(zhì)量濃度的酪蛋白胰蛋白胨溶液（0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/μL）與4 mL的OPA試劑混合，2 min后取其混合液在340 nm波長處測定吸光度，其中以PBS溶液為空白。根據(jù)酪蛋白胰蛋白胨溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線計算消化產(chǎn)物多肽濃度。

1.3.8 DPPH法抗氧化能力的測定

參考Sui Xiaonan等[28]的方法并稍作修改。將SPI、花青素-SPI共價復(fù)合物，最終消化產(chǎn)物粉末及不同濃度的Trolox分別溶于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其質(zhì)量濃度為5 mg/mL，取配制好的樣品溶液100 μL與100 μL的DPPH溶液混合，黑暗條件下放置30 min后在517 nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度。其中以PBS溶液為空白，以Trolox當(dāng)量（nmol/mg）計算樣品抗氧化的能力（以吸光度（y）和Trolox濃度（x）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=－49.209x＋0.074 5，R2=0.99）。

1.3.9 ABTS法抗氧化能力的測定

參考Sui Xiaonan等[28]的方法并稍作修改。稱取0.38 g ABTS和0.067 g過硫酸鉀溶解于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中，混合后黑暗條件下放置12～16 h得到ABTS儲備溶液。將ABTS儲備溶液用0.01 mol/L PBS（pH 7.0）稀釋至在734 nm波長處吸光度讀數(shù)為0.70±0.02后，與上述DPPH測定時的樣品溶液等體積混合，黑暗條件下放置7 min。隨后在734 nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度。其中以PBS溶液為空白，以Trolox當(dāng)量（nmol/mg）計算樣品抗氧化的能力（y=－178.34x＋0.325 2，R2=0.99）。

1.3.10 跨上皮細(xì)胞運(yùn)輸及多肽滲透率的測定

參考Zhang Qiaozhi等[29]的方法，Caco-2細(xì)胞采用DMEM完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、100 U/mL青霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺和100 μg/mL鏈霉素）于25 cm2帶蓋透氣斜口培養(yǎng)瓶中，在無菌培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）孵育。對數(shù)期生長的細(xì)胞通過胰蛋白酶消化法（0.5%胰蛋白酶和0.05% EDTA）傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基每隔1 d更換1 次。實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞介于傳代20～30之間。

對于樣品跨上皮細(xì)胞運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)，Caco-2細(xì)胞密度達(dá)到4.5×105cells/cm2接種于6 孔細(xì)胞養(yǎng)板中，培養(yǎng)基每隔1 d更換1 次。4 d后單層Caco-2細(xì)胞融合，分化21 d后選取電阻值高于300 Ω·cm2的Caco-2單層細(xì)胞用于跨上皮細(xì)胞運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)之前，期間和之后需檢查單層的完整性，電阻值在300 Ω·cm2附近保持穩(wěn)定，并且在與樣品孵育后未觀察到減少的細(xì)胞即為合格細(xì)胞。用Hank's平衡鹽溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS）沖洗選擇的Caco-2單層細(xì)胞兩次，并進(jìn)一步在37 ℃用HBSS平衡30 min。隨后取出Caco-2單層細(xì)胞，取1.5 mL HBSS置于細(xì)胞下室，將最終消化產(chǎn)物粉末溶于HBSS中使其質(zhì)量濃度為1 mg/mL并取0.5 mL置于細(xì)胞上室，同等體積的HBSS代替最終消化產(chǎn)物溶液作為空白。Caco-2單層細(xì)胞在37 ℃和5% CO2條件下孵育2 h后。測量細(xì)胞上室和下室的多肽濃度，多肽滲透率的計算參考公式（4）：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

每組數(shù)據(jù)重復(fù)3 次，利用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)作圖。利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析及相關(guān)性分析（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 三維熒光光譜分析

圖1 SPI和花青素-SPI共價復(fù)合物的三維熒光光譜圖Fig. 1 Three dimensional fluorescence spectra of SPI and anthocyanins-SPI conjugates

三維熒光光譜是一種研究蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的有效手段[30]。圖1展示了SPI和花青素-SPI共價復(fù)合物的三維熒光光譜圖。圖中峰a（λex= λem）表示拉曼散射，峰b（λem= 2λex）表示瑞利散射[23]。峰1（λex= 280 nm，λem= 340 nm）主要表示色氨酸和酪氨酸產(chǎn)生的特征峰[23]，如圖1所示，花青素共價交聯(lián)SPI后使蛋白峰1處的熒光值下降，且同一交聯(lián)條件下，添加的花青素質(zhì)量濃度與蛋白峰1處的熒光值呈反比。而在同一花青素質(zhì)量濃度下，漆酶條件交聯(lián)的花青素-SPI共價復(fù)合物比堿性交聯(lián)的復(fù)合物在峰1處的熒光值更低。這表明花青素與SPI在漆酶條件或堿性條件下可發(fā)生相互作用，且花青素質(zhì)量濃度越大，兩者的相互作用越強(qiáng)；但是花青素質(zhì)量濃度相同時，漆酶條件對花青素與SPI的促交聯(lián)能力強(qiáng)于堿性條件。SPI在峰1處熒光值下降的原因主要是在漆酶或堿性條件下，花青素可被氧化成醌，醌類物質(zhì)可與蛋白多肽鏈上的色氨酸或酪氨酸殘基發(fā)生親核反應(yīng)，從而使蛋白色氨酸或酪氨酸處的熒光值下降[31]。相似的研究結(jié)果在乳鐵蛋白與綠原酸的共價交聯(lián)中也被發(fā)現(xiàn)[32]。此外，圖中峰2（λex= 230 nm，λem= 350 nm）主要代表了多肽鏈骨架結(jié)構(gòu)的特征峰[23]?；ㄇ嗨貙PI共價交聯(lián)后，蛋白峰2處的熒光值降低，這表明花青素使SPI多肽鏈發(fā)生解折疊從而改變了蛋白的三級結(jié)構(gòu)[33]。同時，由于SPI的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使蛋白的色氨酸殘基暴露于親水環(huán)境中，從而致使蛋白色氨酸處的熒光值下降，這可能是峰1處熒光值降低的另一個原因。

2.2 水解度分析

圖2 SPI和花青素-SPI共價復(fù)合物的體外消化水解度Fig. 2 In vitro digestibility of SPI and anthocyanins-SPI conjugates

SPI和花青素-SPI共價復(fù)合物在體外模擬胃腸消化過程中的消化性可用蛋白的水解度表示。如圖2所示，所有樣品的水解度隨消化時間的延長而增大，并在模擬小腸消化后期趨于穩(wěn)定，這主要是因?yàn)殡S消化時間的延長，樣品底物濃度增大，酶活減小，消化物經(jīng)初始階段積累逐漸趨于恒定等原因造成的[34]。由圖2可知，花青素對SPI共價交聯(lián)使得蛋白在胃腸消化階段的水解度上升，隨著花青素質(zhì)量濃度的增大，SPI的水解度不斷升高。尤其是在漆酶條件下，蛋白水解度遠(yuǎn)高于堿性條件下交聯(lián)同質(zhì)量濃度花青素的SPI和天然SPI的水解度。這可能是由于花青素與SPI的共價交聯(lián)改變了蛋白的結(jié)構(gòu)，使得蛋白暴露出更多可以被胃蛋白酶或胰蛋白酶水解的位點(diǎn)，從而使得在模擬胃腸消化期間，花青素交聯(lián)的蛋白水解度增高[35]。

2.3 DPPH法抗氧化能力分析

DPPH法測定樣品的抗氧化性是一種常用的方法[12]。圖3顯示了SPI和花青素-SPI共價復(fù)合物在體外模擬胃腸消化前后的抗氧化性。通過DPPH法測定可知，花青素對SPI的共價交聯(lián)提高了SPI的抗氧化能力，同一交聯(lián)條件下，花青素-SPI共價復(fù)合物的抗氧化能力與花青素的濃度呈正比。就漆酶條件而言，LC1、LC2、LC3的抗氧化能力分別比AC1、AC2、AC3高了9.9%、32.69%、3.29%。眾所周知，花青素具有抗氧化能力[28]，因此花青素-SPI抗氧化能力的增加可歸因于花青素賦予蛋白的抗氧化能力。而同等花青素質(zhì)量濃度時，漆酶條件下的花青素-SPI共價復(fù)合物抗氧化能力要高于堿性條件下的復(fù)合物，這可能由于漆酶對花青素與SPI的促交聯(lián)能力要高于堿性條件，因此漆酶條件下添加同質(zhì)量濃度的花青素到SPI時，真正結(jié)合在蛋白上的花青素醌數(shù)量要多余堿性條件下結(jié)合在SPI上的醌。同樣，Ali等[12]在堿性條件和多酚氧化酶存在條件下對β-乳球蛋白和咖啡酸進(jìn)行共價交聯(lián)，然后對β-乳球蛋白和β-乳球蛋白-咖啡酸共價復(fù)合物用DPPH進(jìn)行抗氧化能力的測定。結(jié)果表明：β-乳球蛋白中咖啡酸的引入提高了β-乳球蛋白的抗氧化能力，且多酚氧化酶條件下的共價復(fù)合物抗氧化能力要高于堿法條件下的復(fù)合物。

圖3 SPI和花青素-SPI共價復(fù)合物消化前后的抗氧化性（DPPH法）Fig. 3 Antioxidant capacity of SPI and anthocyanins-SPI conjugates before and after digestion as measured by DPPH radical scavenging assay

從圖3還可看出，無論是天然SPI還是經(jīng)花青素共價交聯(lián)后的SPI，經(jīng)過胃腸消化后，抗氧化能力都得到提高。這可能要?dú)w因于蛋白在消化過程中產(chǎn)生了具有抗氧化性的肽。同樣的結(jié)果在Rohn等[13]對牛血清白蛋白結(jié)合槲皮素的研究中被發(fā)現(xiàn)，其研究表明，消化后的牛血清白蛋白-槲皮素共價復(fù)合物的抗氧化性高于消化前復(fù)合物的抗氧化性。

2.4 ABTS法抗氧化能力分析

圖4 SPI和花青素-SPI共價復(fù)合物消化前后的抗氧化性（ABTS法）Fig. 4 Antioxidant capacity of SPI and anthocyanins-SPI conjugates before and after digestion as measured by ABTS radical cation scavenging assay

ABTS法是測定樣品抗氧化性的另一種常用方法[36]。如圖4所示，花青素的添加使SPI的抗氧化性能力增強(qiáng)。相較于SPI的抗氧化性，AC3、LC1、LC2、LC3的抗氧化性都有顯著性提升（P＜0.05）。尤其是LC3，抗氧化能力比SPI高出58.72%。這主要是因?yàn)榛ㄇ嗨乇旧砭哂泻軓?qiáng)的抗氧化性，所以在花青素醌交聯(lián)到SPI上形成的共價復(fù)合物具有抗氧化性。而在漆酶條件下，一定質(zhì)量濃度的花青素對SPI的親和力可能高于堿性條件，正如除LC1和AC1外，LC2、LC3的抗氧化性依次高于AC2、AC3。同時，由于SPI被胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后會產(chǎn)生具有抗氧化性的多肽，所以同一樣品經(jīng)過模擬胃腸消化后抗氧化性會升高（圖4）。同樣，You Juan等[36]在研究卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和兒茶素的共價相互作用時，也發(fā)現(xiàn)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的抗氧化性（ABTS法）有所改善。

2.5 多肽滲透率的分析

表1 花青素與大豆分離蛋白共價結(jié)合對多肽滲透率的影響Table 1 Effects of covalent conjugation of anthocyanins and SPI on the permeability of SPI-derived peptides

利用Caco-2單層細(xì)胞進(jìn)行多肽運(yùn)輸?shù)膶?shí)驗(yàn)已經(jīng)被廣泛用于模擬人體小腸對蛋白的吸收[37]。表1展示了SPI和花青素-SPI共價復(fù)合物體外胃腸消化結(jié)束后產(chǎn)生的多肽的細(xì)胞滲透率。相較于天然SPI，共價復(fù)合物的多肽滲透率降低。且隨著花青素-SPI共價復(fù)合物中花青素含量的升高，其復(fù)合物產(chǎn)生的多肽細(xì)胞滲透率逐漸減小。值得注意的是，添加同質(zhì)量濃度花青素時，漆酶交聯(lián)條件下的多肽滲透率降低地更為明顯（P＜0.05）。據(jù)研究報道，多肽的被動吸收主要依賴于多肽和水形成的氫鍵。多肽要透過細(xì)胞膜，需要足夠的能量斷開多肽和水之間的氫鍵[38]。由于花青素是水溶性化合物，因此花青素的共價交聯(lián)增加了SPI的-OH基團(tuán)的量，進(jìn)而增加了花青素-SPI共價復(fù)合物與水之間形成氫鍵的數(shù)量，這可能是花青素交聯(lián)SPI后致使SPI的多肽滲透率降低的原因。而漆酶條件下，添加同質(zhì)量濃度花青素時，SPI交聯(lián)的花青素數(shù)量比堿性條件下更多，由此帶給SPI羥基基團(tuán)的量更多，多肽與水形成的氫鍵也越多，斷開蛋白多肽與水形成的氫鍵所需的能量隨之增多，從而同等時間內(nèi)多肽的滲透率越低。然而，由于多肽如何穿過細(xì)胞膜的具體機(jī)制仍不明晰，所以還需繼續(xù)探究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用花青素在漆酶條件和堿性條件下對SPI進(jìn)行共價交聯(lián)，并將其復(fù)合物進(jìn)行體外模擬胃腸消化，探究花青素共價交聯(lián)SPI后對其分子結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)吸收特性的影響。主要結(jié)論如下：1）隨著花青素質(zhì)量濃度的增加，花青素-SPI共價復(fù)合物的熒光強(qiáng)度逐漸降低，發(fā)色基團(tuán)逐漸被猝滅，多肽鏈解折疊從而改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象。相較于堿性條件，花青素質(zhì)量濃度相同時，漆酶條件下的花青素-SPI共價復(fù)合物熒光猝滅效果更明顯。2）花青素對SPI的共價交聯(lián)提高了蛋白在體外胃腸消化中的水解度，且花青素-SPI共價復(fù)合物中花青素含量與復(fù)合物水解度呈正比。此外，漆酶條件交聯(lián)的復(fù)合物比堿性條件交聯(lián)的復(fù)合物在體外消化過程中水解度要更高。3）花青素與SPI發(fā)生共價相互作用后，蛋白的抗氧化性得到改善。同時，DPPH法和ABTS法都表明，SPI和花青素-SPI共價復(fù)合物消化后的抗氧化性比消化前高，而且無論消化前后，樣品的抗氧化性都隨花青素質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。4）花青素-SPI共價復(fù)合物經(jīng)過體外模擬胃腸消化后產(chǎn)生多肽，其多肽滲透率要低于天然SPI消化后產(chǎn)生的多肽在Caco-2單層細(xì)胞的滲透率，而漆酶條件下的多肽滲透率要低于堿性條件下的多肽滲透率。

以上研究結(jié)論為花青素在漆酶和堿性條件下交聯(lián)SPI后，對蛋白結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)吸收特性的影響提供部分理論參考價值，為SPI在食品中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。