儀淑敏，葉貝貝，張詩雯，余永名，趙文浩，李學鵬，范大明，郁曉君，丁浩宸，黃建聯(lián)，徐永霞，米紅波，勵建榮,*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧省高等學校生鮮食品產業(yè)技術研究院，遼寧 錦州 121013；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；3.遼寧安井食品有限公司，遼寧 鞍山 114100）

冷凍魚糜，又稱生魚糜，是指在采肉、漂洗、精濾之后的魚肉中加入抗凍劑，再經(jīng)攪拌均勻后凍結的魚肉。隨著淡水魚養(yǎng)殖產量的增加以及海洋漁業(yè)資源的不斷減少，淡水魚逐漸成為加工魚糜的主要原料之一。2016年，全國魚糜制品總產量達到155.36萬 t[1]，其中鰱魚作為我國年產量僅次于草魚的第二大魚類，具有肉質鮮美、營養(yǎng)豐富、繁殖迅速、產量高等優(yōu)點，因此逐漸受到了水產品加工企業(yè)的青睞[2]。

冷凍貯藏是目前保存魚糜最常用的方法[3]，抗凍劑的添加是為了防止和延緩凍藏過程中魚糜肌原纖維蛋白的變性，從而延長魚糜的貯藏期。商業(yè)上常用的抗凍劑是蔗糖和山梨醇的混合物，盡管二者抑制魚肉蛋白冷凍變性的效果顯著，但其高甜、高熱量的特性影響了產品的營養(yǎng)價值。因此，低糖低熱量的新型抗凍劑的研究逐漸成為一種趨勢。

現(xiàn)階段新型抗凍劑種類繁多，糖是其中的一大類，糖類的冷凍保護機制可能有以下3 種：一是在冷凍體系中形成的玻璃體，抑制了蛋白的聚集；二是與蛋白質分子周圍的水分子優(yōu)先結合；三是與蛋白質分子氫鍵的結合[4]。專家學者對糖類抗凍劑進行的研究表明，海藻糖能抑制草魚魚糜蛋白在冷凍過程中的變性，延緩魚糜凍藏品質的下降，同時對羅非魚魚糜肌原纖維蛋白也具有一定的抗凍效果[5-6]。

菊粉是一種可溶性的膳食纖維，它是果糖通過β-2,1糖苷鍵聚合而成的線性直鏈多糖，其分子末端連接一個葡萄糖殘基，聚合度在2～60之間，易溶于水，略帶甜味，甜度只有蔗糖的30%～40%[7]。菊粉作為食品和營養(yǎng)的增補劑，被用于各種食品中，具有改善質構、減少熱量等作用，它可以代替脂肪和糖類，成為低卡路里的填充劑，也可以作為一種保水劑[8]。除此之外，菊粉可作為蛋白保護劑[9]，減少蛋白質的變性，而且在凍藏過程中起到穩(wěn)定蛋白質構象的作用，還可能起到減少冰晶生成的作用[10-11]，如菊粉可作為菌種保藏抗凍劑的主要成分之一，用于對細胞和蛋白的保護[12]。菊粉與蔗糖、果糖等大多數(shù)糖類抗凍劑不同，它是不易消化的碳水化合物，因此，對血糖的影響極小，適合糖尿病患者使用；另外，菊粉在冷凍干燥過程中穩(wěn)定蛋白質的能力比海藻糖更好[13]。本實驗將菊粉加入冷凍鰱魚魚糜中，旨在探究菊粉對鰱魚魚糜蛋白在凍藏過程中的保護作用，以期尋找一種低糖低熱量的抗凍保護劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚 錦州市水產市場；菊粉（食品級，平均聚合度26） 陜西慈緣生物技術有限公司；食鹽錦州市大潤發(fā)超市；蔗糖、山梨醇（食品級） 河南中泰食化有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、Tris、氯化鉀、鹽酸、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、尿素、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、8-苯胺基-1-萘磺酸銨（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS）（均為分析純） 天津市天力化學試劑有限公司；ATP酶測試盒 南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設備

YC200采肉機和精濾機 諸城市凱成良才食品機械廠；T78-90櫻花牌脫水機 慈溪櫻花電器有限公司；ZB-20型數(shù)顯恒溫水浴鍋 諸城市瑞恒食品機械廠；AF-10全自動雪花制冰機 斯科茨曼制冰機系統(tǒng)（上海）有限公司；MS105DU分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IKA-T25均質機 德國IKA公司；SORVALL STRATOS型冷凍高速離心機 德國Sigma公司；精密pH計 美國Mettler-Toledo公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；970CRT熒光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

新鮮鰱魚→前處理（去頭、去鱗、去內臟）→采肉→用清水漂洗2 次→0.15%鹽水漂洗1 次→脫水（控制水分質量分數(shù)為78%）→精濾→空斬得鰱魚魚糜

將鰱魚魚糜按抗凍劑的添加分為6 組，分別為：空白組（0%菊粉）、添加0.5%菊粉、添加1.0%菊粉、添加1.5%菊粉、添加2.0%菊粉和添加商業(yè)抗凍劑（4.0%蔗糖＋4.0%山梨醇）。將各組樣品凍藏于－18 ℃條件下，定期取樣測定指標。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

根據(jù)Kunihiko等[14]的方法稍作修改。稱取20 g魚糜，加入5 倍體積的含0.1 mol/L KCl的20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）提取液，6 000 r/min勻漿，每勻漿30 s停30 s，重復5 次，整個勻漿過程混合液置于冰浴中。勻漿液于4 ℃、10 000×g離心20 min，去除上清液，沉淀再用5 倍上述提取液重復3 次。最后得到的沉淀用0.6 mol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 7）提取液溶解，勻漿后于4 ℃靜置提取1 h，離心得到上清液，即為肌原纖維蛋白溶液。

1.3.3 鹽溶性蛋白含量的測定

根據(jù)Xiong Guangquan等[15]的方法稍作修改。提取不同凍藏時間的肌原纖維蛋白，將其用蒸餾水稀釋至2 mg/mL，在4 ℃、5 000×g離心15 min，取上清液，測定其質量濃度。鹽溶性蛋白含量為提取的不同凍藏時間肌原纖維蛋白離心后上清液的蛋白質量濃度和初始肌原纖維蛋白質量濃度的比值，按照下式計算：

1.3.4 Ca2＋-ATPase活性的測定

將提取出來的肌原纖維蛋白溶液用0.6 mol/L、pH 7.0的KCl溶液稀釋至5 mg/mL后，采用ATP酶測試盒測定。150 μL肌原纖維蛋白（5 mg/mL）與試劑盒試劑混合后37 ℃反應10 min，再通過試劑盒試劑終止反應，將混合液3 500×g離心5 min后取上清液，取150 μL上清液與試劑盒試劑混合后45 ℃反應20 min，取出冷卻至室溫，660 nm波長處測定吸光度。肌原纖維蛋白Ca2＋-ATPase活性表示為單位時間內單位蛋白質釋放的無機磷物質的量，單位μmol/（mg·min）。

1.3.5 總巰基和活性巰基含量的測定

根據(jù)Zhou Aimei等[16]的方法稍作修改。提取出的肌原纖維蛋白溶液用0.6 mol/L、pH 7.0的KCl稀釋至5 mg/mL?？値€基的測定：取此溶液0.5 mL，加入4.5 mL 0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH 6.8，含8 mol/L尿素、2% SDS和10 mmo1/L EDTA），混勻后取4 mL加入0.4 mL 0.1%的DTNB溶液（0.2 mol/L Tris-HCl，pH 6.8），在40 ℃反應25 min后用紫外-可見分光光度計于412 nm波長處測吸光度，用0.6 mol/L、pH 7.0的KCl溶液同時做一空白實驗?；钚詭€基的測定在不添加尿素的情況下進行?？値€基含量和活性巰基以蛋白質計，單位mo1/105g，其中分子消光系數(shù)取13 600 L/（mol·cm）。

1.3.6 表面疏水性的測定

根據(jù)Benjakul等[17]的方法稍作修改。將提取出的肌原纖維蛋白以10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0，含0.6 mol/L NaCl）稀釋成0、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL系列質量濃度，體積均為4 mL，在20 ℃水浴10 min，加入20 μL 8 mmol/L ANS的0.1 mol/L磷酸鹽溶液（pH 7.0），反應完后在激發(fā)波長374 nm、發(fā)射波長485 nm條件下，用熒光分光光度計測定其熒光強度，表面疏水性以熒光強度與肌動球蛋白質量濃度對應的曲線斜率表示。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行分析處理，利用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 菊粉對鰱魚魚糜鹽溶性蛋白含量的影響

肌原纖維蛋白是一種鹽溶性蛋白，其含量是蛋白質變性的一個重要指標，反映了肌球蛋白桿部的變化趨勢。在凍藏過程中，肌原纖維蛋白變性會導致氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵和離子相互作用的形成，從而其鹽溶性會下降[18-19]。

圖1 添加菊粉的鰱魚魚糜鹽溶性蛋白含量的變化Fig. 1 Change in salt extractable protein content of sliver carp surimi with added inulin

由圖1可知，空白組、添加商業(yè)抗凍劑和不同比例菊粉的實驗組在凍藏5 周過程中鹽溶性蛋白含量均呈現(xiàn)下降趨勢，凍藏5 周后，添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%菊粉實驗組和添加商業(yè)抗凍劑實驗組的鹽溶性蛋白含量分別下降了54.91%、45.16%、33.88%、27.18%、36.08%和22.98%，其中空白組的下降幅度最大，添加商業(yè)抗凍劑后下降幅度最小，添加1.5%菊粉實驗組較不添加和添加其他比例菊粉的鹽溶性蛋白含量下降程度小。添加2%菊粉實驗組的抗凍效果開始下降，原因可能是添加過量的菊粉等糖類抗凍劑，使抗凍劑和蛋白質的比例過高，導致抗凍劑的結晶和失穩(wěn)，消除了其對蛋白質的保護作用[20]。米順利等[21]研究表明，海藻糖也能夠明顯抑制羅非魚魚糜鹽溶性蛋白在凍藏過程中的降低。Zhou Aimei等[22]實驗結果發(fā)現(xiàn)，在25 周的凍藏過程中，8%的海藻糖控制鹽溶性蛋白下降的效果比商業(yè)抗凍劑要好。由此可知，雖然各組樣品在凍藏期間均出現(xiàn)了蛋白質的冷凍變性，但是1.5%菊粉能較好的抑制鹽溶性蛋白含量的下降，具有一定的抗凍性。

2.2 菊粉對鰱魚魚糜肌原纖維蛋白Ca2＋-ATPase活性的影響

魚肉肌球蛋白頭部具有Ca2＋-ATP活性，可以反映肌球蛋白的完整性，也被廣泛地作為反映魚肉或魚糜蛋白變性的常用指標之一[23]。魚肉在凍藏過程中，蛋白中氫鍵、疏水鍵、二硫鍵和離子鍵的改變會導致蛋白結構變化，尤其是肌球蛋白頭部，從而使蛋白固有的酶活性降低[24]。

由圖2可知，空白組、添加商業(yè)抗凍劑和不同比例菊粉的實驗組在凍藏5 周過程中肌原纖維蛋白Ca2＋-ATPase活性均呈現(xiàn)下降趨勢，凍藏5 周后，添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%菊粉實驗組和添加商業(yè)抗凍劑實驗組的Ca2＋-ATPase活性分別下降了87.13%、77.81%、65.83%、63.02%、75.00%和58.43%，其中空白組的下降速度最快，添加商業(yè)抗凍劑實驗組下降速度最慢，添加1.5%菊粉實驗組的Ca2＋-ATPase活性比不添加和添加其他比例菊粉實驗組的下降速度慢。其他學者也得到了相似的結論，劉安軍等[25]研究發(fā)現(xiàn)，4%聚葡萄糖作為抗凍劑可以明顯抑制鳙魚魚糜的肌原纖維蛋白Ca2＋-ATPase活性的下降。Xiong Guangquan等[15]研究表明1%的魔芋葡甘聚糖可以減輕Ca2＋-ATPase活性的降低，對草魚肌原纖維蛋白有較好的冷凍保護作用。凍藏過程中，冰晶的形成會改變肌球蛋白的頭部結構，從而導致Ca2＋-ATPase活性降低，菊粉等糖類抗凍劑會使冰晶的形成受阻，從而降低Ca2＋-ATP活性的下降程度[26]。由上述結果可知，不同比例的菊粉作為糖類抗凍劑均能起到抑制Ca2＋-ATPase活性降低的作用，其中1.5%的菊粉效果更明顯，效果更接近商業(yè)抗凍劑。

圖2 添加菊粉的鰱魚魚糜肌原纖維蛋白Ca -ATPase活性的變化Fig. 2 Change in Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein from sliver carp surimi with added inulin

2.3 菊粉對鰱魚魚糜肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量的影響

巰基作為肌原纖維蛋白中最具反應活性的功能基團[27]，其數(shù)量對于蛋白結構的穩(wěn)定至關重要?？値€基包括活性巰基和隱藏的巰基，分別存在于肌球蛋白頭部和輕鏈酶解肌球蛋白部分[28]，也有一部分隱藏于肌球蛋白內部。在凍藏或凍融過程中，蛋白結構變化會導致巰基的位置發(fā)生改變，埋藏在蛋白結構內部的巰基可能暴露于蛋白表面，半胱氨酸上的巰基發(fā)生氧化或二硫鍵的交換反應導致二硫鍵的形成[29]，活性巰基更易氧化成二硫鍵，因此蛋白質冷凍變性往往會使其總巰基和活性巰基的含量減少。

圖3 添加菊粉的鰱魚魚糜肌原纖維蛋白總巰基含量的變化Fig. 3 Change in total sulfhydryl content of myofibrillar protein from sliver carp surimi with added inulin

由圖3可知，空白組、添加商業(yè)抗凍劑和不同比例菊粉的實驗組在凍藏5 周過程中總巰基含量均呈現(xiàn)下降趨勢，凍藏5 周后，添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%菊粉實驗組和添加商業(yè)抗凍劑實驗組的總巰基分別下降了61.06%、47.91%、37.53%、33.96%、38.74%和31.09%。

圖4 添加菊粉的鰱魚魚糜肌原纖維蛋白活性巰基含量的變化Fig. 4 Change in surface-reactive sulfhydryl content of myofibrillar protein from sliver carp surimi with added inulin

圖4 表明，活性巰基呈現(xiàn)總巰基相同的變化趨勢，凍藏5 周后，實驗組的活性巰基分別下降了61.65%、39.50%、37.84%、33.79%、39.26%和30.22%。王寧等[30]研究表明海藻糖可以抑制大黃花魚肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基的下降，Nopianti等[31]也發(fā)現(xiàn)聚葡萄糖對金線魚的總巰基和活性巰基有抑制下降的作用。在凍藏過程中，形成的冰晶會使肌原纖維蛋白結構發(fā)生改變，埋藏在分子內部的巰基暴露，被氧化形成二硫鍵，導致巰基的減少，菊粉等糖類抗凍劑對冰晶的形成有抑制作用，降低了巰基的下降速度，與圖2的Ca2＋-ATPase活性的變化趨勢相同[32]。從總巰基和活性巰基含量的變化情況可知，菊粉能有效抑制總巰基和活性巰基含量的下降，其中1.5%菊粉的抗凍效果優(yōu)良，能很大程度上抑制蛋白質的變性，起到保護肌原纖維蛋白的作用。

2.4 菊粉對鰱魚魚糜肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性可以有效地反映蛋白質結構的微小變化。新鮮魚糜蛋白的疏水性氨基酸殘基一般位于蛋白質分子內部，具有較低的表面疏水性，而在凍藏過程中，蛋白質可因變性而發(fā)生構型轉化，使原先位于蛋白質分子內部的疏水性氨基酸殘基暴露并發(fā)生氧化，從而導致蛋白質表面疏水性增加[33-34]。

由圖5可知，空白組、添加商業(yè)抗凍劑和不同比例菊粉的實驗組在凍藏5 周過程中表面疏水性均呈現(xiàn)上升趨勢，凍藏5 周后，添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%菊粉實驗組和添加商業(yè)抗凍劑實驗組的表面疏水性分別上升了844.78%、810.28%、665.11%、605.67%、740.07%和542.74%。上述結果表明，添加抗凍劑后，凍藏鰱魚魚糜肌原纖維蛋白表面疏水性的增加得到明顯的抑制，周愛梅等[35]研究表明，8%海藻糖和8%聚葡萄糖也能抑制鯪魚魚糜蛋白表面疏水性，具有一定的抗凍性。本實驗中，菊粉對鰱魚魚糜肌原纖維蛋白保護效果較好，可能是因為菊粉等糖類抗凍劑通過與蛋白質反應基結合，使處于飽和狀態(tài)的蛋白質分子難以聚集變性；另一方面，糖類抗凍劑含有的游離羥基，與水分子結合，導致“共晶點”溫度的降低，減緩冰晶的形成[36-37]。由此可知，菊粉等糖類抗凍劑的加入可在很大程度上穩(wěn)定蛋白的結構，在添加不同比例的菊粉實驗中，1.5%的菊粉最能起到商業(yè)抗凍劑類似的效果。

圖5 添加菊粉的鰱魚魚糜肌原纖維蛋白表面疏水性的變化Fig. 5 Change in surface hydrophobicity of myofibrillar protein from sliver carp surimi with added inulin

3 結 論

1.5 %菊粉對凍藏的鰱魚魚糜能起到較好的抗凍效果，凍藏5 周后，其鹽溶蛋白含量、Ca2＋-ATPase活性、總巰基含量和活性巰基含量分別下降了27.18%、63.02%、33.96%、33.79%；表面疏水性上升了263.89。商業(yè)抗凍劑的鹽溶蛋白含量、Ca2＋-ATPase活性、總巰基含量和活性巰基含量分別下降了22.98%、58.43%、31.09%和30.22%，表面疏水性上升了236.47。1.5%菊粉效果更接近商業(yè)抗凍劑，可作為一種低熱低甜度的新型抗凍劑進行下一步的開發(fā)。