蔣鵬飛，董子奕，彭俊，馬俊旭，梁凱霞，彭清華

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.天津市人民醫(yī)院 眼科，天津 300121；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 眼科，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

視網(wǎng)膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）病程冗長(zhǎng)，治療困難，尚無(wú)特效療法，視網(wǎng)膜新生血管是RVO的常見并發(fā)癥。文獻(xiàn)記載蠐螬可治療目疾，并有破血、行瘀、散結(jié)及明目的功效，前期研究發(fā)現(xiàn)蠐螬提取物可促進(jìn)RVO出血的吸收，抑制視網(wǎng)膜新生血管[1-2]。為明確其機(jī)制，本文通過(guò)復(fù)制RVO動(dòng)物模型，探討蠐螬提取物對(duì)視網(wǎng)膜新生血管的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用40只健康實(shí)驗(yàn)性兔，雌雄兼用，體重1.8～2.3 kg（合格證號(hào)：湘醫(yī)動(dòng)字第30-015號(hào)）。蠐螬提取物制備參考陽(yáng)長(zhǎng)明等[3]的方法。復(fù)方血栓通片（揚(yáng)州中惠制藥有限公司），一抗為兔抗白細(xì)胞分化抗原68（cluster of differentiation 68，CD68）多克隆抗體（武漢博士德公司），二抗為生物素標(biāo)記的IgG（武漢博士德公司）。

1.2 設(shè)備

電子秤（JY0001，上海天平儀器廠），勒克斯照度計(jì)（ZDS-10，上海嘉定學(xué)聯(lián)儀器廠），眼科手術(shù)顯微鏡（YZZOT，蘇州醫(yī)療器械設(shè)備廠），PCR儀（德國(guó)Biometra公司），凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR+，美國(guó)Bio-Rad公司），微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司），垂直板電泳槽（DYCZ-24D，北京六一儀器廠），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛公司），水平電轉(zhuǎn)槽（DYCP-40C，北京六一儀器廠），超純水儀（美國(guó)Millipore公司），紫外可見分光光度計(jì)（SP-752，上海Spectrum公司），恒溫?fù)u床（THZ-82A，金壇華特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），水平搖床（WD-9405B，北京六一儀器廠），掃描儀（9000F MarkⅡ，日本Canon公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組將40只實(shí)驗(yàn)性兔依次編為1～40號(hào)，通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法，從第3行第5個(gè)數(shù)開始抄錄40個(gè)數(shù)，將這些數(shù)字除以4，余數(shù)為1作為空白組，余數(shù)為2作為模型組，余數(shù)為3作為復(fù)方血栓通組，余數(shù)為0作為蠐螬組，最終每組10只動(dòng)物，20只眼。

1.3.2 動(dòng)物模型的復(fù)制應(yīng)用光化學(xué)動(dòng)力法復(fù)制實(shí)驗(yàn)性RVO模型，模型組、復(fù)方血栓通組及蠐螬組兔雙眼散瞳后，麻醉動(dòng)物，固定于裂隙燈前，安置三面鏡；激光器指示光斑定位于視盤邊緣的靜脈后，自耳緣靜脈緩慢推入20%熒光素鈉注射液（0.3 ml/kg），30 s內(nèi)推完。注藥后，照射雙側(cè)視網(wǎng)膜靜脈，同時(shí)避開伴行的動(dòng)脈，有明顯的遠(yuǎn)端靜脈擴(kuò)張時(shí)停止[4]。

1.3.3 動(dòng)物給藥空白組、模型組以生理鹽水5 ml/kg灌胃；復(fù)方血栓通組：復(fù)方血栓通0.1 g/kg溶于生理鹽水制成混懸液，5 ml/kg灌胃；蠐螬組：蠐螬提取物1.5 ml/kg灌胃。各組均為1次/d，持續(xù)至模型復(fù)制后3周，各組于模型復(fù)制后1、3、7、14及28 d隨機(jī)處死2只動(dòng)物。

1.3.4 取材動(dòng)物耳緣靜脈注射空氣處死后，立即摘除眼球（包括球后視神經(jīng)2 mm），于角膜緣后0.5 mm處剪開眼球壁，去除眼前節(jié)組織和玻璃體，手術(shù)顯微鏡下剝離眼球壁激光斑部位的視網(wǎng)膜，逐級(jí)酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)視乳頭顳側(cè)旁開1 mm縱向做4μm厚的切片，烘干備用。

1.3.5 熒光素眼底血管造影術(shù)（fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA）模型復(fù)制后7、14及28 d對(duì)兔行FFA檢查，將FFA結(jié)果輸入Mias-2000型顯微圖像分析系統(tǒng)自動(dòng)測(cè)量無(wú)灌注區(qū)和視盤的面積，并求出其比值[5]。分為無(wú)灌注區(qū)、有灌注區(qū)、無(wú)新生血管（甲類）、有新生血管（乙類）。

1.3.6 免疫組織化學(xué)法將取材的切片行蘇木精-伊紅染色，檢測(cè)CD68的表達(dá)。一抗為兔抗CD68多克隆抗體，二抗為生物素標(biāo)記的IgG，在光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織的變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組無(wú)灌注區(qū)與視盤面積比值比較

給藥7 d后，模型組中央靜脈熒光滲漏、出血，出現(xiàn)無(wú)灌注區(qū)，尚無(wú)新生血管出現(xiàn)；復(fù)方血栓通組和蠐螬組出現(xiàn)無(wú)灌注區(qū)，但滲漏、出血較模型組少。給藥28 d后，模型組滲漏、出血的靜脈周圍無(wú)灌注區(qū)面積增大，并出現(xiàn)新生血管；復(fù)方血栓通組滲漏、出血明顯減少；蠐螬組滲漏、出血基本吸收。復(fù)方血栓通組、蠐螬組與模型組給藥后7、14及28 d的無(wú)灌注區(qū)與視盤面積比值比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的無(wú)灌注區(qū)與視盤面積比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.862，P=0.000）；②3組無(wú)灌注區(qū)與視盤面積比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=53.221，P=0.000）；③3組無(wú)灌注區(qū)與視盤面積比值變化趨勢(shì)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.622，P=0.737）。見表1。

2.2 各組CD68的表達(dá)水平比較

空白組視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞均表現(xiàn)為無(wú)表達(dá)或極少量表達(dá)（見圖1A）。模型組1 d時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞增多（見圖1B），3 d時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量達(dá)最高峰（見圖1C），7、14及28 d時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較前依次減少，28 d時(shí)多轉(zhuǎn)變?yōu)闂U狀的靜止?fàn)顟B(tài)（見圖1D～F）。復(fù)方血栓通組小膠質(zhì)細(xì)胞1 d時(shí)即有活化表現(xiàn)，3 d時(shí)活化達(dá)高峰（見圖2A～E）。蠐螬組小膠質(zhì)細(xì)胞在1 d時(shí)同樣表現(xiàn)出了活躍的小膠質(zhì)細(xì)胞，3 d時(shí)即表現(xiàn)出小膠質(zhì)細(xì)胞受抑制，28 d時(shí)接近正常水平（見圖2F～I(xiàn)）。復(fù)方血栓通組、蠐螬組與模型組在1、3、7、14及28 d的CD68表達(dá)水平比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)CD68表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.373，P=0.000）；②3組CD68表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=92.425，P=0.000）；③3組CD68表達(dá)的變化趨勢(shì)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.743，P=0.569）。見表2。

表1 各組不同時(shí)間無(wú)灌注區(qū)與視盤面積比值比較 （n =2，±s）

表1 各組不同時(shí)間無(wú)灌注區(qū)與視盤面積比值比較 （n =2，±s）

組別眼數(shù)7 d14 d28 d模型組416.34±3.5117.72±2.2019.42±2.69復(fù)方血栓通組411.88±2.148.22±1.974.18±1.75蠐螬組49.78±1.876.26±1.952.90±1.50

圖1 空白組和模型組不同時(shí)間小膠質(zhì)細(xì)胞CD68的表達(dá) （光學(xué)顯微鏡×400）

圖2 復(fù)方血栓通組和蠐螬組不同時(shí)間小膠質(zhì)細(xì)胞CD68的表達(dá) （光學(xué)顯微鏡×400）

表2 各組CD68表達(dá)水平比較 （n =2，±s）

表2 各組CD68表達(dá)水平比較 （n =2，±s）

組別眼數(shù)1 d3 d7 d14 d28 d空白組4194.06±9.37196.26±10.78191.12±2.44197.72±4.29194.96±3.21模型組4142.80±8.6985.90±5.01114.36±10.21144.86±6.24164.08±5.59復(fù)方血栓通組4146.16±8.26108.56±8.41128.54±9.63168.48±8.24182.56±4.88蠐螬組4143.18±3.53125.72±4.90160.78±6.34186.20±3.69197.42±2.21

3 討論

RVO發(fā)病率高，是僅次于糖尿病視網(wǎng)膜病變的第二大致盲性視網(wǎng)膜血管病，其發(fā)生機(jī)制目前尚不明了[6-11]。蠐螬是金龜子的幼蟲，首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主惡血血瘀痹氣，破折血在脅下堅(jiān)滿痛，月閉，目中淫膚，青翳白膜?！薄稌x書》中有此藥治療目疾的記載：“吳中書郎戰(zhàn)沖，母王氏失明，婢取蠐螬蒸熟與食，王以為美，沖還知之，抱母慟哭，母目即開?！薄侗静菥V目》中記載此藥味咸微溫，有破血、行瘀、散結(jié)、通乳、解毒、消瘡及明目的功能?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為蠐螬對(duì)RVO的缺血視網(wǎng)膜組織有保護(hù)作用，能夠治療RVO所致的視網(wǎng)膜病理?yè)p傷[1-2]。

隨著視網(wǎng)膜作為免疫赦免區(qū)概念的打破，越來(lái)越多的學(xué)者開始研究小膠質(zhì)細(xì)胞在視網(wǎng)膜疾病中的活化及作用，尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞的活化在RVO的相關(guān)研究中取得了一定的進(jìn)展[12-14]。RVO時(shí)，組織出現(xiàn)缺血缺氧改變，小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)迅速活化并趨附在損傷組織周圍。大量研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜上持續(xù)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元有損傷作用[15-18]。視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)表達(dá)較多，不同表達(dá)因子的選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)有一定影響[10，19-20]。本研究選取針對(duì)兔的CD68作為指標(biāo)，CD68從形態(tài)上能很清楚地顯示小膠質(zhì)細(xì)胞形狀的多樣性。

本研究發(fā)現(xiàn)，蠐螬提取物與復(fù)方血栓通均可改善RVO后組織灌注情況，但蠐螬提取物較復(fù)方血栓通效果更好。對(duì)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活化的表達(dá)因子CD68的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方血栓通和蠐螬提取物都使小膠質(zhì)細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱，3 d后蠐螬組比復(fù)方血栓通組的陽(yáng)性表達(dá)減少，說(shuō)明蠐螬提取物不僅能抑制RVO后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，而且比單純的活血化瘀藥能更快地發(fā)揮對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制作用，這應(yīng)該與蠐螬提取物的免疫抑制作用有關(guān)。