張國亮，朱奇坤，曾輝，王濤，高峰，王瑞

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 胸外科，河北 石家莊 050011）

食管癌是危及人類健康的惡性腫瘤[1]，具有早期轉(zhuǎn)移、侵襲、浸潤等特點(diǎn)。因此，研究食管癌侵襲、轉(zhuǎn)移的基因，能為精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。PTPRS是抑制基因，與肝癌、肺腺癌的預(yù)后相關(guān)[2-3]，但關(guān)于PTPRS在食管腺癌的表達(dá)，國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。本研究采用組織芯片和免疫組織化學(xué)法對71例配對的食管黏膜組織、癌組織及癌旁組織中PTPRS蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，探討其與食管腺癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年2月—2016年5月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行根治性切除的71例食管腺癌患者的癌組織及配對的癌旁組織、食管正常黏膜組織。其中，癌旁組織是由有經(jīng)驗(yàn)的手術(shù)醫(yī)師和病理科醫(yī)師確定距離腫瘤病灶2 cm處組織，食管正常黏膜組織是其距離癌組織≥5 cm組織。納入患者為首次診療且術(shù)前無放化療或者合并其他腫瘤。其中，男性51例，女性20例；年齡34～71歲，平均59.6歲。具有完整的病例資料，腫瘤分級、TNM分期按照國際抗癌聯(lián)盟2009年第七版食管腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)[4]。術(shù)后隨訪次/3個(gè)月，隨訪終點(diǎn)為死亡、失訪或生存至截止日期，隨訪截止時(shí)間為2017年1月1日，平均隨訪時(shí)間29.5個(gè)月。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽訂知情同意書。

1.2 組織芯片的制備

取癌組織、癌旁組織及食管正常黏膜組織以10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水浸蠟，石蠟包埋；蘇木精-伊紅染色、切片、病理診斷，標(biāo)記出腫瘤組織及正常黏膜組織范圍。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)出組織芯片的陣列排列方式和組織類型，用10 mm組織穿刺針在每個(gè)標(biāo)本的標(biāo)記點(diǎn)取樣；然后將其依次排列于模具內(nèi)預(yù)融的石蠟中，構(gòu)成組織微陣列蠟塊，待石蠟?zāi)毯笄谐?μm微陣列切片，將其貼附于載玻片上，封蠟備用。

1.3 免疫組織化學(xué)SP法

采用免疫組織化學(xué)SP法檢測PTPRS蛋白的表達(dá)，具體步驟如下：組織芯片置于60℃烤箱中烘烤30 min后，經(jīng)二甲苯脫蠟及乙醇水化，浸泡于3%過氧化氫H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶，置于檸檬酸緩沖液（pH6.0）中高壓加熱抗原修復(fù)3 min，羊血清室溫封閉30 min，滴加PTPRS一抗（美國Sigma公司，稀釋度1∶100），37℃溫箱孵育1 h，加二抗酶標(biāo)抗小鼠/羊IgG聚合物（上?；蚩萍加邢薰荆?，37℃溫箱孵育30 min，3-二氨基聯(lián)苯胺顯色3 min，流水洗，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片，鏡下閱片。

1.4 結(jié)果判定

切片由2位獨(dú)立觀察員采用雙盲法對所有切片進(jìn)行評估。PTPRS蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞膜，根據(jù)細(xì)胞膜染色強(qiáng)度作為評判標(biāo)準(zhǔn)。高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野，觀察細(xì)胞染色強(qiáng)度及計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)所占細(xì)胞總數(shù)的百分比。評分標(biāo)準(zhǔn)，①按染色強(qiáng)度計(jì)分：無色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。②按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：陰性為0分；陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。最后將2項(xiàng)得分結(jié)果相乘：總分≤4分為低表達(dá)；＞4分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線和復(fù)發(fā)曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)，采用Cox回歸模型評估各變量對預(yù)后的影響，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管腺癌、癌旁組織及食管正常黏膜組織中PTPRS蛋白表達(dá)率比較

PTPRS蛋白在食管正常黏膜組織和食管腺癌組織中表達(dá)（見圖1）。PTPRS蛋白在正常食管黏膜組織、癌旁組織、癌組織中表達(dá)率分別為60.56%、52.11%和36.62%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.376，P=0.015）；PTPRS蛋白在食管腺癌組織中表達(dá)量低于正常食管黏膜組織（P＜0.05）；癌旁組織中PTPRS蛋白表達(dá)水平與正常食管黏膜比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 PTPRS表達(dá)水平與食管腺癌臨床病理特征的關(guān)系

不同臨床分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、分化程度、神經(jīng)受侵及脈管瘤栓的食管腺癌患者的PTPRS蛋白高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而其他臨床病理特征比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。PTPRS蛋白在臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期的食管腺癌組織中的低表達(dá)率[76.92%(30/39)]高于Ⅰ、Ⅱ期[46.88%(15/32)]（P＜0.05）；高分化食管腺癌患者的PTPRS高表達(dá)率高于中、低分化食管癌患者（P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者PTPRS高表達(dá)率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）；浸潤至纖維膜及周圍組織患者PTPRS蛋白低表達(dá)率[75.56%(34/45)]高于浸潤肌層以下的患者[42.31%(11/26)]（P＜0.05）。PTPRS蛋白表達(dá)水平與神經(jīng)受侵、脈管瘤栓相關(guān)（P＜0.05）。食管腺癌組織中PTPRS高表達(dá)率在不同年齡、性別、飲酒史、吸煙史、腫瘤家族史、手術(shù)方式、腫瘤大小及腫瘤位置方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

圖1 食管正常黏膜組織及食管腺癌組織中PTPRS蛋白的表達(dá)

表1 食管腺癌臨床病理特征與PTPRS表達(dá)水平的關(guān)系 [n =71，例（%）]

2.3 PTPRS蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析顯示，PTPRS低表達(dá)患者生存率與高表達(dá)患者生存率比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.764，P=0.002）；食管腺癌患者PTPRS蛋白低表達(dá)組生存率低于高表達(dá)組（見圖2）。兩組患者的中位生存時(shí)間分別為24和58個(gè)月，兩組患者總生存率分別為33.33%和57.69%。兩組患者中位復(fù)發(fā)時(shí)間分別為20和50個(gè)月，兩組患者總復(fù)發(fā)率分別為73.33%和50.00%。PTPRS蛋白低表達(dá)患者復(fù)發(fā)率與高表達(dá)患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.468，P=0.001）；PTPRS蛋白低表達(dá)患者復(fù)發(fā)率高于PTPRS蛋白高表達(dá)患者（見圖3）。經(jīng)單因素Cox回歸分析顯示，脈管瘤栓、神經(jīng)受侵、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、臨床分期及PTPRS是影響食管腺癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）；進(jìn)一步多因素Cox回歸分析顯示，分化程度、PTPRS表達(dá)是影響食管腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表2、3。

圖2 食管腺癌患者術(shù)后生存時(shí)間與PTPRS蛋白表達(dá)的關(guān)系

圖3 食管腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間與PTPRS蛋白表達(dá)的關(guān)系

表2 食管腺癌預(yù)后的單因素Cox回歸分析參數(shù)

表3 食管腺癌預(yù)后的多因素Cox回歸分析參數(shù)

3 討論

PTPRS基因是1988年從人胎盤基因組DNA文庫首次被發(fā)現(xiàn)，位于染色體19p13.3[5]。其編碼的蛋白PTPRS和蛋白酪氨酸磷酸酶受體F[6]、蛋白酪氨酸磷酸酶受體D[7]一樣，是PTPR家族中Ⅱa亞型成員[8]，其胞外區(qū)由多種免疫球白和纖維結(jié)合素Ⅲ重復(fù)片段等組成[9]。最初發(fā)現(xiàn)PTPRS在神經(jīng)再生、突觸形成中發(fā)揮重要作用[10]。王智超等[2]研究發(fā)現(xiàn)，PTPRS在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起重要作用，被認(rèn)為是一個(gè)新型抑癌基因。MORRIS等[11]發(fā)現(xiàn)，在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中PTPRS基因的缺失可達(dá)26%，其編碼的PTPRS缺失與細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)。同時(shí)MORRIS等[3]發(fā)現(xiàn)，PTPRS蛋白的低表達(dá)與肺腺癌預(yù)后密切相關(guān)。全基因組測序發(fā)現(xiàn)PTPRS基因突變，如膽管細(xì)胞癌A1384T[12]，結(jié)直腸癌V224M[13]和惡性黑色素瘤P141S[14]。DAVIS等[15]發(fā)現(xiàn)，PTPRS與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。提示PTPRS可能是腫瘤潛在的抑癌基因，其表達(dá)的PTPRS蛋白可能參與腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移。

目前，關(guān)于PTPRS在食管腺癌中的表達(dá)及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的研究較少。筆者對71例食管腺癌患者研究發(fā)現(xiàn)，PTPRS蛋白在食管腺癌組織的表達(dá)低于正常黏膜組織和癌旁組織，提示PTPRS可能是腫瘤的抑癌基因，在食管腺癌發(fā)生過程中起一定的作用。筆者進(jìn)一步分析PTPRS蛋白的表達(dá)與食管腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，PTPRS蛋白在早期食管腺癌組織中的表達(dá)高于晚期患者，在侵犯組織廣泛及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中表達(dá)較低，提示PTPRS可能參與食管腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密不可分。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PTPRS蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度、神經(jīng)受犯及脈管瘤栓相關(guān)，其在有神經(jīng)浸潤、脈管瘤栓的組織中的低表達(dá)率分別高達(dá)84.00%、82.61%，提示PTPRS不僅與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，而且與腫瘤血管形成及組織侵襲有關(guān)。PTPRS的表達(dá)量與腫瘤位置、大小無關(guān)，可能與樣本量相對較少有關(guān)。

本組實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討PTPRS蛋白表達(dá)與食管腺癌患者的生存關(guān)系。Kaplan-Meier生存曲線顯示，隨著時(shí)間的推移，PTPRS蛋白低表達(dá)患者生存率低于高表達(dá)患者。Cox單因素及多因素回歸分析顯示，PTPRS蛋白表達(dá)水平與食管腺癌患者預(yù)后相關(guān)，與PTPRS在頭頸部鱗癌、肝癌及肺腺癌研究結(jié)果一致[2-3，11]。

綜上所述，PTPRS可能是腫瘤的抑癌基因，其在食管腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的調(diào)控作用。PTPRS在食管腺癌中確切的生物影響和分子機(jī)制仍不清楚，因此，筆者將繼續(xù)增加樣本量，完成術(shù)后長期隨訪，明確PTPRS在食管腺癌中扮演的角色，以便為食管腺癌的靶向治療及預(yù)后監(jiān)測等方面提供參考。