瞿靜雯 王健 李擁軍 王強(qiáng) 尹修遠(yuǎn)

摘要：卵母細(xì)胞培養(yǎng)是胚胎工程的重要組成部分，是體外受精、胚胎移植及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基礎(chǔ)。不斷完善卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)條件，可以大大提高卵母細(xì)胞體外成熟的質(zhì)量，充分發(fā)揮綿羊卵母細(xì)胞的繁殖潛力。綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)受到多種因素的限制，其中培養(yǎng)液成分包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、激素、卵泡液、生長因子、抗氧化物和維生素等6個方面。筆者對綿羊卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)的培養(yǎng)液成分相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在提高綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的質(zhì)量和促進(jìn)體外胚胎技術(shù)研究。

關(guān)鍵詞：綿羊;卵母細(xì)胞;成熟培養(yǎng);研究進(jìn)展;培養(yǎng)液成分

中圖分類號： S826.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0022-04

卵母細(xì)胞體外成熟（in vitro maturation，簡稱IVM）是指從卵巢卵泡腔中采集未成熟的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus-oocyte complexes，簡稱COCs），在體外成熟培養(yǎng)液中，經(jīng)過成熟培養(yǎng)后，排出第一極體的過程[1]。卵母細(xì)胞的體外成熟、體外受精（in vitro fertilization，簡稱IVF）、胚胎移植技術(shù)（embryo transfer，簡稱ET）及轉(zhuǎn)基因技術(shù)（cloning and gene transfer）在提高母畜繁殖力、加快品種改良、縮短世代間隔等繁殖相關(guān)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的品質(zhì)是決定動物體外人工輔助生殖技術(shù)成敗的關(guān)鍵因素之一。研究表明，卵母細(xì)胞體外成熟是一個復(fù)雜的過程，除了內(nèi)源性激素（卵泡刺激素、促黃體素和雌二醇）的表達(dá)調(diào)控之外[3]，成熟培養(yǎng)液中外源性的分子也是影響卵母細(xì)胞成熟發(fā)育的重要因素[4]。Wei等研究發(fā)現(xiàn)，在體外成熟培養(yǎng)過程中，馬絨毛膜促性腺激素（equine chorionic gonadotropin，簡稱eCG）提高了綿羊卵母細(xì)胞的成熟率，減少了卵母細(xì)胞的凋亡，并增強(qiáng)了卵泡刺激素受體（follicle-stimulating hormone receptor，簡稱FSHR）、促黃體素受體（luteinizing hormone receptor，簡稱LHR）和促性腺激素釋放激素受體（gonadotropin-releasing hormone receptor，簡稱GnRHR）的表達(dá)，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)[5]。Anchordoquy等研究發(fā)現(xiàn)，將血管內(nèi)皮生長因子在培養(yǎng)0～3 h和半胱胺在培養(yǎng)4～24 h時連續(xù)加入成熟培養(yǎng)液中，提高了牛卵母細(xì)胞質(zhì)的成熟質(zhì)量和體外培養(yǎng)的效率，促進(jìn)了牛卵母細(xì)胞的發(fā)育能力;當(dāng)卵母細(xì)胞在同時含有血管內(nèi)皮生長因子和半胱胺的卵母細(xì)胞成熟液中培養(yǎng)24 h后，雖然提高了牛卵母細(xì)胞中谷胱甘肽（GSH，具有清除代謝過程中產(chǎn)生的自由基的作用，防止胚胎因過氧化作用而導(dǎo)致早衰）的含量，但對胚胎發(fā)育具有不利影響[6]。卵母細(xì)胞的體外成熟受多方面因素的作用，如季節(jié)、年齡、卵母細(xì)胞的來源、培養(yǎng)液成分等諸多要素。雖然關(guān)于綿羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的報道較多，但是與體內(nèi)卵母細(xì)胞正常成熟相比，卵母細(xì)胞的體外成熟還存在一些問題，比如質(zhì)量較差、受精率較低、早期胚胎發(fā)育停滯等。因此，如何提高綿羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的質(zhì)量成為促進(jìn)體外胚胎技術(shù)的關(guān)鍵之一。本研究就綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的培養(yǎng)液成分進(jìn)行綜述，旨在為提高綿羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的質(zhì)量及其在動物人工輔助生殖領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供理論參考。

1 基礎(chǔ)培養(yǎng)液對綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響

目前，國內(nèi)外研究者多選擇合成輸卵管液（synthetic oviduct fluid，簡稱SOF）和TCM199（tissue culture medium 199）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液進(jìn)行綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)，為卵母細(xì)胞的成熟提供營養(yǎng)因子，成熟率可達(dá)79%[7]。SOF是一種成分簡單的培養(yǎng)液，常應(yīng)用于早期胚胎的培養(yǎng)，主要由幾種常規(guī)的無機(jī)鹽類和能量底物組成，如乳酸、丙酮酸鈉、葡萄糖，使用時須要同時添加氨基酸。TCM199是一種成分復(fù)雜的培養(yǎng)液，除了含有幾種常規(guī)的無機(jī)鹽類和能量底物外，還含有維生素、嘌呤、核苷酸及微量表面活性劑等成分[8-9]。體外受精后的胚胎培養(yǎng)需要添加卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，簡稱FSH）和促黃體素（luteinizing hormone，簡稱LH）。目前，綿羊卵母細(xì)胞體外成熟體系中以TCM199應(yīng)用較為廣泛[10]。此外，為了提高綿羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的成熟率，通常還要在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加血清、激素、卵泡液、生長因子、抗氧化物等。

2 血清對綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響

血清對哺乳動物卵母細(xì)胞的成熟具有一定的促進(jìn)作用，它含有卵母細(xì)胞生長所需的多種氨基酸、維生素、激素、生長因子和抗氧化物質(zhì)等。在卵母細(xì)胞成熟液中添加血清，能為顆粒細(xì)胞提供營養(yǎng)成分，防止卵母細(xì)胞卵黃膜硬化，保持卵母細(xì)胞的完整性，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。目前常用于卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中的血清有胎牛血清（fetal bovine serum，簡稱FBS）、新生牛血清、發(fā)情牛血清和牛血清白蛋白。研究表明，由于胎牛還未與外界接觸，胎牛血清中含有抗體、補體等，對細(xì)胞有害的成分最少，所以胎牛血清優(yōu)于牛血清白蛋白;由于發(fā)情牛血清中含有一定濃度的激素和促成熟因子，能促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，所以發(fā)情牛血清優(yōu)于胎牛血清[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞成熟液中添加10% FBS和20% FBS，并補充以丙酮酸、谷氨酰胺、促黃體素、促卵泡素和雌二醇（E2），在卵母細(xì)胞成熟率方面沒有顯著差異（82%與79%）;但是，在含有20% FBS培養(yǎng)液中發(fā)育成熟的卵母細(xì)胞受精后，繼續(xù)用含有20% FBS的發(fā)育液培養(yǎng)時，其卵裂率顯著高于其他試驗組，發(fā)育至桑椹胚、囊胚期的早期胚胎數(shù)也高于其他組[10]。

3 激素對綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響

卵母細(xì)胞成熟液中常添加的激素有FSH、LH和E2。FSH和LH是參與卵泡發(fā)生最主要的蛋白質(zhì)激素，與顆粒細(xì)胞、內(nèi)膜細(xì)胞上的受體結(jié)合并激活環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，簡稱cAMP）系統(tǒng)，導(dǎo)致類固醇激素的合成，尤其是雌二醇的合成，從而促進(jìn)卵泡的卵母細(xì)胞發(fā)育和排卵。FSH促進(jìn)卵泡的發(fā)育，在生長期的大部分時間內(nèi)，卵母細(xì)胞停滯在前Ⅰ期，需要LH刺激形成排卵峰，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞中cAMP的含量上升，卵母細(xì)胞中cAMP含量下降，減數(shù)分裂重啟[11]。在成熟培養(yǎng)液中添加適當(dāng)濃度的LH，LH受體受到刺激后，外層顆粒細(xì)胞表達(dá)RNA編碼的表皮生長因子樣蛋白，從而實現(xiàn)LH信號從外層向內(nèi)層的轉(zhuǎn)化[12]，抑制次黃嘌呤介導(dǎo)的分裂停滯，而誘導(dǎo)減數(shù)分裂重啟，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟。Hobbs等研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中同時添加10 μg/mL FSH和10 μg/mL LH提高了卵母細(xì)胞的成熟率，常和 1 μg/mL E2同時添加以促進(jìn)卵母細(xì)胞質(zhì)的成熟[13]。馬絨毛膜促性腺激素（eCG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）一樣，具有FSH和LH的雙重作用，對FSHR和LHR具有高度親和力。研究表明eCG能提高非繁殖季節(jié)奶牛和母羊的生殖能力、排卵數(shù)和妊娠率[14-16]。Wei等在蘭州大尾綿羊卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加20 μg/mL eCG，與添加10 IU/mL FSH相比，提高了卵母細(xì)胞成熟率（從51.7%至48.5%），減少了卵母細(xì)胞的凋亡（從19%至20.6%）[15]。

4 卵泡液對綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響

卵泡液（follicular fluid，簡稱FF）在體內(nèi)的作用機(jī)制尚未被闡明，目前，對于卵泡液能否作為卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)的添加物，觀點尚不一致。多數(shù)研究表明，卵泡液中存在類固醇激素、促性腺激素和生長因子，包括胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor-1，簡稱IGF-Ⅰ）和表皮生長因子（epidermal growth factor，簡稱EGF），能夠提高質(zhì)核成熟的同步化，影響卵母細(xì)胞的成熟、受精以及胚胎的發(fā)育[17-18]。有研究報道，類固醇激素的刺激作用對于卵母細(xì)胞的成熟收效甚微，有的還起到輕微的抑制作用[19]。卵泡液中的促減數(shù)分裂甾醇（follicular fluid-meiosis-activating sterol，簡稱FF-MAS）膽固醇合成的中間產(chǎn)物，被認(rèn)為是促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的候選物。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)F-MAS與自發(fā)或促性腺激素誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟的時間不同，說明膽固醇很可能不是主要促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的因子[20]。Germoush等研究了綿羊卵泡液（sheep follicular fluid，簡稱SFF）對卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精后早期胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果表明，在成熟液中添加10%和20%的SFF，對成熟率和卵裂率沒有顯著影響，而在添加40% SFF的成熟液中，卵母細(xì)胞成熟率和卵裂率較添加之前顯著提高;與其他試驗組相比，在成熟液中添加10% SFF，顯著提高了囊胚的發(fā)育率[21]。然而，也有研究者認(rèn)為，40%的卵泡液對卵母細(xì)胞的成熟具有抑制作用，卵泡液對體外卵母細(xì)胞成熟的影響還有待進(jìn)一步研究。

5 生長因子對綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響

卵泡卵母細(xì)胞的發(fā)育是由促性腺激素和生長因子協(xié)同調(diào)節(jié)的。體外卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中對卵母細(xì)胞的成熟和胚胎早期發(fā)育具有促進(jìn)作用的生長因子有表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。

5.1 表皮生長因子

表皮生長因子是具有多功能效應(yīng)的促細(xì)胞分裂因子，能刺激多種細(xì)胞的增殖，使處于G0期的細(xì)胞進(jìn)入S期。研究已證明表皮生長因子能將卵泡邊緣的LH信號傳遞給COCs，是排卵信號傳導(dǎo)中的重要組成部分。最新研究發(fā)現(xiàn)，EGF信號下調(diào)體細(xì)胞信號3′，5′-環(huán)鳥嘌呤單磷酸，提供減數(shù)分裂誘導(dǎo)信號，引起減數(shù)分裂的恢復(fù)，同時能促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟過程中蛋白質(zhì)的合成，從而提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量和受精能力[22-23]。EGF由黃體和內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生，通過介導(dǎo)有絲分裂蛋白激酶3和1（MAPK3/1）途徑，從而中斷cAMP的運輸，導(dǎo)致分裂成熟復(fù)始，促進(jìn)卵母細(xì)胞的體外成熟[24]。尹耀學(xué)等研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液中添加EGF可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞體外成熟[25]。

5.2 轉(zhuǎn)化生長因子

轉(zhuǎn)化生長因子是一組具有生物活性的多肽類物質(zhì)，這些多肽因子能誘發(fā)原本貼壁生長的正常細(xì)胞出現(xiàn)可逆性轉(zhuǎn)化的表型以促使細(xì)胞生長，也能誘導(dǎo)指示細(xì)胞產(chǎn)生可逆轉(zhuǎn)化。主要分為α型TGF和β型TGF，相關(guān)結(jié)果表明，TGF-α能改善卵母細(xì)胞成熟的質(zhì)量和受精后的發(fā)育潛能，然而其確切的機(jī)制還不完全清楚[10]。TGF-β是一種多功能的細(xì)胞活化素并且具有多種形式，它們屬于一個大的基因家族，在細(xì)胞生長方面具有多種作用，比如分化、遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)的形成、細(xì)胞表面分子表達(dá)的調(diào)控等[26]。最近TGF-β在卵母細(xì)胞成熟過程中的傳播途徑成為研究的熱點，TGF-β在結(jié)構(gòu)和功能上調(diào)節(jié)EGF，協(xié)同作用使減數(shù)分裂恢復(fù)，而刺激卵母細(xì)胞的成熟。陳靜波等研究表明，在成熟培養(yǎng)液中添加1 ng/mL TGF-β 能促進(jìn)豬體外卵母細(xì)胞核和裸卵的成熟[27]。

5.3 胰島素樣生長因子

胰島素樣生長因子是一種作用于多種組織和器官，具有多種生理功能的多效性營養(yǎng)因子多肽，能增加葡萄糖和氨基酸的吸收，抑制蛋白質(zhì)降解，刺激各種細(xì)胞的增殖和分化[28]。有研究表明，IGF-Ⅰ可以誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞LH受體的表達(dá)，維持卵泡的生長，抑制卵泡閉鎖，能促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精[29]。趙曉娥等研究表明，在山羊卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加IGF-Ⅰ，可以顯著提高卵母細(xì)胞成熟率，尤其是EGF和IGF-Ⅰ聯(lián)合使用時[30]。Bezerra等研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)液中添加100 ng/mL IGF-Ⅰ能夠促進(jìn)原始卵泡的激活和細(xì)胞增殖并且通過PI3K/AKT途徑減少DNA碎片的產(chǎn)生[31]。

5.4 血管內(nèi)皮生長因子

血管內(nèi)皮生長因子是一種特殊的細(xì)胞分裂劑和潛在的血管分化因子，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生，促進(jìn)細(xì)胞遷移，抑制細(xì)胞凋亡，提高血管和微血管對大分子物質(zhì)的通透性[32]。它在哺乳動物生殖調(diào)控中也起重要作用，能夠顯著提高卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散和卵母細(xì)胞的核質(zhì)成熟，促進(jìn)卵母細(xì)胞的體外成熟。宋凱等研究了VEGF對綿羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響，結(jié)果表明，在含有胎牛血清（fetal bovine serum，簡稱FBS）的體系中添加VEGF能有效促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎的早期發(fā)育，最適添加量為5 ng/mL[33]。Araújo等的研究表明，100 ng/mL VEGF可以代替10 ng/mL EGF+50 ng/mL IGF-Ⅰ 在體外卵母細(xì)胞成熟的過程中恢復(fù)減數(shù)分裂，調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟[34]。但有關(guān)VEGF促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟和早期胚胎發(fā)育的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

6 抗氧化物和維生素對綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響

卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過程中，由于細(xì)胞代謝產(chǎn)生過量的活性氧（reactive oxygen species，簡稱ROS），會導(dǎo)致線粒體功能障礙，損害DNA，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和蛋白質(zhì)的氧化變化，抑制受精率，引起細(xì)胞死亡[35]。因此，許多研究人員在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液和胚胎發(fā)育液中加入了多種抗氧化劑，以減少ROS對胚胎發(fā)育過程中的有害影響，如低分子量的含硫基化合物包括β-巰基乙醇、半胱氨酸、胱氨酸和半胱胺[36]。谷胱甘肽（GSH）是一種存在于卵母細(xì)胞中的天然抗氧化劑，并且在不同發(fā)育階段GSH表達(dá)量也發(fā)生變化，能夠清除對細(xì)胞發(fā)育有損害作用的過氧化物。半胱胺是能夠使胱氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸的一種低分子量硫基化合物，半胱氨酸能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞內(nèi)GSH的合成[37]。郭洪等的研究表明，在綿羊卵母細(xì)胞成熟液中添加100 μmoL/L半胱氨酸能提高卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟的能力[38]。

7 小結(jié)與展望

卵母細(xì)胞成熟包括旁分泌、自分泌和自分泌體等一系列復(fù)雜的過程，所涉及的信號通路最終都轉(zhuǎn)化為對cAMP的調(diào)控。在對海星、爪蟾、哺乳動物等不同物種的研究中，在卵母細(xì)胞溫育過程中添加cAMP類似物或刺激cAMP產(chǎn)生的藥理學(xué)物質(zhì)，導(dǎo)致卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP含量升高[39]，現(xiàn)已確認(rèn)，高濃度的cAMP會抑制減數(shù)分裂的進(jìn)行，使其停留在減數(shù)分裂休止期。所以卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的下降，是減數(shù)分裂恢復(fù)的前提。磷酸二酯酶（phosphodiesterase，簡稱PDE）是一種在卵巢中呈區(qū)域化分布的、專門負(fù)責(zé)第二信使cAMP和環(huán)鳥苷酸（cyclic guanosine monophosphate，簡稱cGMP）的酶[40-41]。PDE3家族和同工酶PDE4家族共同調(diào)節(jié)cAMP的平衡，Tsafriri等通過原位雜交方法，利用特異性標(biāo)記的PDE3、PDE4異構(gòu)體探針，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDE3主要在卵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，PDE4更多是在顆粒細(xì)胞中表達(dá)，但是由PDE3介導(dǎo)的卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的下降和由PDE4介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞中cAMP濃度的上升，二者之間是否存在因果關(guān)聯(lián)還值得進(jìn)一步深究[42]。

外胚胎技術(shù)由于能夠迅速擴(kuò)繁，提高母羊的繁殖力，從而在生產(chǎn)上可以得到廣泛應(yīng)用。綿羊卵母細(xì)胞的體外成熟是受多種因素共同作用完成的，如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間，培養(yǎng)液成分等，任何一種因素最終都是通過上調(diào)磷酸二酯酶的活性，平衡卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，使減數(shù)分裂恢復(fù)，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟。因此，篩選出最適添加成分的組合是至關(guān)重要的。而培養(yǎng)出高質(zhì)量的綿羊卵母細(xì)胞是體外胚胎技術(shù)的前提。在未來的研究中，借助高通量技術(shù)在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和表觀遺傳學(xué)等領(lǐng)域深入研究卵母細(xì)胞生長和成熟的調(diào)控機(jī)制是提高卵母細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量的發(fā)展趨勢。

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