牛寶珍 李娜 劉艷紅 王興龍 陳春麗 文天仙 周亞 杜民

摘要：采集云南省5個(gè)不同地域的巨：紅河曼耗（M）、怒江下游（N）、怒江壩（B）、瀾滄江上游（L）、景洪（J）各12尾巨共計(jì)60個(gè)樣本進(jìn)行CO Ⅰ基因克隆測(cè)序。結(jié)果表明，5個(gè)巨群體的T、C、A、G 4種堿基平均含量如下：怒江壩（B）群體T、C、A、G堿基含量分別為274%、27.6%、28.0%、17.0%，景洪（J）群體T、C、A、G堿基含量分別為274%、27.6%、28.0%、17.0%，瀾滄江上游（L）群體T、C、A、G堿基含量分別為27.4%、27.6%、28.0%、17.0%，紅河曼耗（M）群體T、C、A、G堿基含量分別為27.3%、27.6%、28.1%、17.0%，怒江下游（N）群體T、C、A、G堿基含量分別為27.3%、27.6%、28.2%、16.9%;5個(gè)巨群體的A+T含量均大于C+G含量。用MEGA 5.0軟件構(gòu)建5個(gè)群體系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示景洪和紅河曼耗聚為一支，瀾滄江上游大多數(shù)個(gè)體單獨(dú)聚為一支，怒江壩和怒江下游群體混合聚為一支;曼耗和景洪的群體間遺傳距離（9.096）最大，本研究結(jié)果可為巨的資源保護(hù)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：云南省;巨;CO Ⅰ基因;遺傳多樣性

中圖分類號(hào)： S917.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）10-0056-03

巨（Bagarius yarrelli）分布于中國(guó)云南的怒江、瀾滄江和元江水系，隸屬于硬骨魚(yú)綱（Osterichthyes）、鲇形目（Siluriformes）、科（Sisordae）、屬（Bagarius）[1]。巨是產(chǎn)地的主要食用魚(yú)類[2]。目前，對(duì)于巨魚(yú)的研究主要包括巨的生物學(xué)特性[2]和野生巨的生物學(xué)特性[3]、食性[4]、人工繁殖與胚胎發(fā)育[5]和巨細(xì)胞色素氧化酶基因多態(tài)性及系統(tǒng)進(jìn)化的研究[6]、巨野生群體遺傳多樣性的RAPD分析[7]、巨線粒體DNA ND6基因克隆及多態(tài)性分析[8]、巨魚(yú)線粒體12S rRNA和16S rRNA基因克隆及多態(tài)性分析[9]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，目前各種分子標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于各種生物的分子系統(tǒng)分類和物種鑒定研究，其中線粒體CO Ⅰ基因序列是最常用的分子標(biāo)記之一[10]。Hebert等提出了利用線粒體細(xì)胞CO Ⅰ基因的部分序列建立全球動(dòng)物的DNA條碼（DNA barcode）標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，從而進(jìn)行物種簡(jiǎn)單有效的識(shí)別和鑒定工作[11]。區(qū)別于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，DNA條形碼技術(shù)更加簡(jiǎn)單有效且不受人為和客觀因素的影響，因?yàn)镈NA條形碼技術(shù)是直接用堿基順序來(lái)反映物種的客觀指標(biāo)，對(duì)于不同地域魚(yú)類的遺傳和進(jìn)化關(guān)系的鑒定更為簡(jiǎn)單有效[12]。單云晶等利用線粒體CO Ⅰ基因序列對(duì)5個(gè)不同的鯉養(yǎng)殖品進(jìn)行遺傳多樣性分析[13];曹艷等基于線粒體CO Ⅰ基因序列對(duì)分布于渤海、黃海、東海和南海海域的6個(gè)群體藍(lán)點(diǎn)馬鮫遺傳多樣性進(jìn)行了比較[14];線粒體CO Ⅰ基因序列對(duì)于鳥(niǎo)類的系統(tǒng)分類也有很好的依據(jù)性，李濤等對(duì)雀科13屬36種鳥(niǎo)類的CO Ⅰ基因部分序列初步分析了雀科鳥(niǎo)類之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[15];這些研究都表明線粒體CO Ⅰ基因序列對(duì)于物種的分類以及不同地理位置的同一物種的進(jìn)化關(guān)系都是簡(jiǎn)單且有效的手段。由于現(xiàn)代工業(yè)化的加快，缺乏物種的保護(hù)，巨魚(yú)數(shù)量減少，已被列入云南省水生野生動(dòng)植物保護(hù)名錄[16]。為保護(hù)巨群體的多樣性，對(duì)不同巨群體在分子水平上進(jìn)行遺傳多樣性研究，為今后建立基于DNA分子標(biāo)記的巨物種提供資料基礎(chǔ)。本試驗(yàn)選用來(lái)自瀾滄江上游（L）、怒江壩（B）、紅河曼耗（M）、景洪（J）以及怒江下游（N）不同群體的巨作為試驗(yàn)材料，采用基因克隆方法獲得線粒體CO Ⅰ基因全序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，探討不同巨群體的遺傳和進(jìn)化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用2013年10月至2017年6月采自中國(guó)云南臨滄市瀾滄江上游（L）、西雙版納傣族自治州景洪市（J）、紅河曼耗江段（M）、怒江傈僳族自治州怒江壩大橋（B）以及怒江傈僳族自治州三江口怒江下游（N）的巨各12尾，依次編號(hào)為 1～12，取其背部肌肉組織放入1.5 mL EP管中并浸入無(wú)水乙醇，做好標(biāo)記置于冰箱-20 ℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

采用酚-氯仿方法[13]提取巨基因組DNA，1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照并保存在 -20 ℃ 冰箱。巨PCR擴(kuò)增所用的引物為杜民等[17]設(shè)計(jì)合成的1對(duì)簡(jiǎn)并引物，其名稱和序列分別為Baya09F：5′-GAGTGAAAAYCTCCTAGTCYCT-3′，Baya09F：5′-GTTTCTCATTTAATWGAKCCTCC-3′，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠檢測(cè)的目的PCR產(chǎn)物利用凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司）回收、純化、連接轉(zhuǎn)化后，利用通用M13引物進(jìn)行菌液PCR后將篩選后的陽(yáng)性克隆樣品送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN 5.2.2軟件進(jìn)行比對(duì)，采用DnaSP 5.10.01軟件分析核苷酸序列，采用MEGA 5.0軟件對(duì)序列的堿基含量、轉(zhuǎn)換和顛換比分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)測(cè)序的結(jié)果用DNAMAN 5.2.2軟件對(duì)60個(gè)巨的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)并用DNAsp[18]軟件比對(duì)后發(fā)現(xiàn)在5個(gè)群體60個(gè)樣本序列共存在59個(gè)單倍型，其中怒江下游12個(gè)序列存在11個(gè)單倍型，其余4個(gè)群體的12個(gè)序列均發(fā)現(xiàn)12個(gè)單倍型;利用MEGA 5.0[19]軟件中的Kimura雙參數(shù)模型[20]分析5個(gè)巨群體之間的堿基轉(zhuǎn)換/顛換（R）的范圍在 0.691～31.798，5個(gè)群體之間堿基的平均轉(zhuǎn)換/顛換比值范圍為 2.864～9.096。60個(gè)體CO Ⅰ基因序列的全長(zhǎng)為 1 551 bp，保守位點(diǎn)1 144個(gè)、變異位點(diǎn)428個(gè)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)267個(gè)、單態(tài)突變位點(diǎn)160個(gè)。5個(gè)巨群體堿基組成百分比結(jié)果見(jiàn)表1。

利用MEGA 5.0軟件中Kimura 2-parameter model參數(shù)對(duì)本研究5個(gè)群體60個(gè)巨CO Ⅰ基因核苷酸序列分別進(jìn)行群體內(nèi)和群體間的遺傳距離分析，群體間平均遺傳距離見(jiàn)表2，右上角為轉(zhuǎn)換+顛換（Ts+Tv），群體間平均遺傳距離左下角為轉(zhuǎn)換/顛換（Ts/Tv）。

本研究選擇斑馬魚(yú)（Danio rerio）作為外群，NCBI上面的登錄號(hào)為NC_002333。 利用5個(gè)群體60尾巨和斑馬魚(yú)基于Kimura雙參數(shù)模型建立的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖1。

3 討論

3.1 巨CO Ⅰ基因堿基組成

線粒體基因?qū)倌赶颠z傳且穩(wěn)定，線粒體CO Ⅰ基因既有足夠的變異，又便于PCR擴(kuò)增，使其成為DNA條形碼基因之一[21-22]，利用其核苷酸序列的差異，可以進(jìn)行物種鑒別、遺傳及進(jìn)化關(guān)系分析，被廣泛應(yīng)用于鳥(niǎo)類、魚(yú)類、昆蟲(chóng)和動(dòng)物的鑒別[23]。本研究采用基因克隆測(cè)序方法比較了云南省內(nèi)3個(gè)河流5個(gè)不同群體（M-紅河曼耗、N-怒江下游、B-怒江壩、L-瀾滄江上游、J-景洪），各12尾巨共計(jì)60個(gè)樣本的線粒體CO Ⅰ基因全長(zhǎng)序列的堿基組成和單倍型進(jìn)行分析。結(jié)果表明，巨線粒體CO Ⅰ基因核苷酸序列長(zhǎng)度為 1 551 bp，其保守位點(diǎn)1 144個(gè)、變異位點(diǎn)428個(gè)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)267個(gè)、單一突變位點(diǎn)160個(gè)。5個(gè)群體巨A+T的含量（55.5%）明顯高于C+G的含量（44.5%），G含量（17.0%）最低，這與單云晶等的研究結(jié)果[14]一致。從原核生物到真核生物，其CO Ⅰ基因組中堿基A+T高的現(xiàn)象廣泛存在，這一現(xiàn)象的產(chǎn)生與基因長(zhǎng)度以及密碼子反密碼子間結(jié)合能力的大小有關(guān)[24]。

3.2 基于CO Ⅰ基因的不同巨群體的親緣關(guān)系

5個(gè)群體中每12個(gè)個(gè)體中得到的單倍型除了怒江下游（N）群體為11個(gè)單倍型外，其余4個(gè)群體各得到12個(gè)單倍型，60個(gè)個(gè)體共得到59個(gè)單倍型，這可能是由于本試驗(yàn)利用的是CO Ⅰ基因的全長(zhǎng)序列而不是特定的條形碼所需的部分序列（648 bp）[22];5個(gè)群體的單倍型不存在共享的情況，表明5個(gè)巨魚(yú)群體的遺傳多樣性較高。不同群體的單倍型個(gè)體在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上交織在一起，其中怒江壩（B）群體和怒江下游（N）交叉最為嚴(yán)重，這一結(jié)果與董新培等在日本沼蝦群體中的研究結(jié)果[25]相一致。紅河曼耗（M）群體和景洪（J）群體和另外其他3個(gè)不存在交叉情況，且紅河曼耗（M）群體和景洪（J）群體的遺傳距離較小。5個(gè)群體中怒江壩（B）群體和怒江下游（N）群體聚為一支、紅河曼耗（M）和景洪（J）聚為一支;瀾滄江上游（L）單獨(dú)為一支并且靠近怒江壩（B）和怒江下游（N）的分支，這可能與其不同流域的基因交流有關(guān)系。巨是分布在東南亞的越南、柬埔寨、緬甸、印度及中國(guó)云南的元江（紅河）、瀾滄江和怒江的底棲性魚(yú)類，由于味道鮮美而受到當(dāng)?shù)鼐用竦南矏?ài)，本研究中的巨1個(gè)群體來(lái)自紅河的曼耗段（M），而紅河最終經(jīng)過(guò)中國(guó)的河口流向越南后最終到達(dá)北部灣，2個(gè)群體來(lái)自瀾滄江的瀾滄縣段（L，瀾滄江上游）和景洪段（J），而最終經(jīng)過(guò)緬甸、老撾、泰國(guó)、柬埔寨、越南后進(jìn)入南海，2個(gè)群體來(lái)自怒江的潞江壩段（B）和三江口段（N，怒江下游），怒江經(jīng)由緬甸后流入印度洋;這樣的地理狀況為巨群體間的基因交流提供了可能性。怒江壩、景洪、瀾滄江上游、曼耗、怒江下游同一群體內(nèi)的遺傳距離分別為4.629、4.000、2.697、3.427、6.718，以怒江下游群體內(nèi)的遺傳距離最大。遺傳距離越大表明該群體內(nèi)的遺傳多樣性越豐

富，本研究中怒江下游群體的遺傳多樣性最豐富、怒江壩群體次之、瀾滄江上游群體的遺傳多樣性最小。遺傳多樣性的豐富程度表明了這個(gè)生物群體對(duì)于外界環(huán)境的適應(yīng)能力，本研究的結(jié)果可為巨的遺傳資源保護(hù)提供分子方面的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳小勇. 云南魚(yú)類名錄[J]. 動(dòng)物學(xué)研究，2013，34（4）：281-337.

[2]田樹(shù)魁，薛晨江，冷 云，等. 巨的生物學(xué)特性初步研究[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志，2009，30（3）：115-117.

[3]劉躍天，田樹(shù)魁，冷 云，等. 野生巨生物學(xué)特性研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（18）：302-303，307.

[4]冷 云，田樹(shù)魁，劉躍天，等. 巨食性初步研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（19）：329-330.

[5]薛晨江，張正雄，馬建顏，等. 巨人工繁殖初報(bào)與胚胎發(fā)育觀察[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志，2012，33（5）：54-56.

[6]杜 民，牛寶珍，王婷婷，等. 巨細(xì)胞色素氧化酶基因多態(tài)性及系統(tǒng)進(jìn)化研究[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，25（3）：337-343.

[7]牛寶珍，杜 民，劉艷紅，等. 巨線粒體DNA ND6基因克隆及多態(tài)性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：62-65.

[8]杜 民，牛寶珍，賈夢(mèng)應(yīng)，等. 巨線粒體12S rRNA和16S rRNA基因克隆及多態(tài)性分析[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，39（5）：83-89.

[9]杜 民，牛寶珍，羅彩艷，等. 巨野生群體遺傳多樣性的RAPD分析[J]. 淡水漁業(yè)，2015，45（1）：15-19，24.

[10]肖武漢，張亞平. 魚(yú)類線粒體DNA的遺傳與進(jìn)化[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2000，24（4）：384-391.

[11]Hebert P N，Cywinska A，Ball S L，et al. Biological identi-fications through DNA barcodes[J]. Proc Royal Soc London B：Biol Sci，2003，270（1512）：313-321.

[12]杜啟艷，常重杰. DNA條形碼在鑒定物種中的應(yīng)用[J]. 生物學(xué)教學(xué)，2010，35（12）：60-61.

[13]單云晶，魯翠云，李 超，等. 基于線粒體CO Ⅰ基因序列的5種鯉養(yǎng)殖品種遺傳多樣性研究[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2013，20（5）：931-938.

[14]曹 艷，章 群，宮亞運(yùn)，等. 基于線粒體CO Ⅰ序列的中國(guó)沿海藍(lán)點(diǎn)馬鮫遺傳多樣性[J]. 海洋漁業(yè)，2015，37（6）：485-493.

[15]李 濤. 基于線粒體CO Ⅰ基因序列的雀科鳥(niǎo)類分子系統(tǒng)發(fā)育[D]. 西安：陜西師范大學(xué)，2008.

[16]鄭蘭平，陳小勇，楊君興. 瀾滄江中下游魚(yú)類現(xiàn)狀及保護(hù)[J]. 動(dòng)物學(xué)研究，2013，34（6）：680-686.

[17]Du M，Niu B Z，Jia M Y，et al. The complete mitochondrial genome of the bagarius yarrelli from honghe river[J]. Earth and Environmental Science，2016，41：12-31.

[18]Librado P，Rozas J. DnaSP v5：a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics （Oxford，England），2009，25（11）：1451-1452.

[19]Tamura K，Dudley J，Nei M，et al. MEGA 4：molecular evolutionary genetics analysis（MEGA） software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2007，24：1596-1599.

[20]Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences[J]. Journal of Molecular Evolution，1980（16）：111-120.

[21]Fedorov A，Saxonov S，Gilbert W. Regularities of context-dependent codon bias in eukaryotic genes[J]. Nucleic Acids Research，2002，30（5）：1192-1197.

[22]Tautz D，Arctander P，Minelli A，et al. DNA points the way ahead in taxonomy[J]. Nature，2002，418（6897）：479.

[23]彭居俐，王緒楨，何舜平. DNA條形碼技術(shù)的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2008，32（6）：916-919.

[24]黃 原. 分子系統(tǒng)學(xué)——原理、方法和應(yīng)用[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998：70-76.

[25]董新培，武小斌，萬(wàn)海付，等. 河北3個(gè)日本沼蝦野生群體線粒體DNA D-Loop基因序列變異及種群遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2017，41（2）：182-188.