付品婷，鄔光敏，郭媛媛

（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院/云南省阜外心血管病醫(yī)院 血管外科，云南 昆明 650032）

動(dòng)靜脈特異性內(nèi)膜增生引起的血管狹窄，往往是自體靜脈移植、人工或組織工程血管植入、腔內(nèi)支架置入術(shù)后血管再狹窄的主要原因，目前研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)靜脈分子指紋EphrinB2/EphB4參與內(nèi)膜增生過程的調(diào)控，本綜述對EphrinB2/EphB4參與介導(dǎo)的相關(guān)信號通路作闡述，以期為臨床干預(yù)提供方向。

1 動(dòng)靜脈分化和血管分子指紋

中胚層細(xì)胞分化形成的原始毛細(xì)血管網(wǎng)經(jīng)過個(gè)體復(fù)雜的血管生成、分化，重構(gòu)為動(dòng)脈、靜脈和淋巴管網(wǎng)[1]，動(dòng)脈與靜脈不僅僅存在結(jié)構(gòu)與功能的區(qū)別，兩者更具有基因水平上的差異，在促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞激酶受體（erythropoietinproducing hepatocyte kinase receptor，Eph）及其Ephrin配體家族中，EphB4、EphrinB2在胚胎發(fā)育期血管中的表達(dá)較的其他成員出現(xiàn)時(shí)間更早，EphB4在E9.0（小鼠）就表達(dá)于靜脈內(nèi)皮，而EphrinB2比EphB4稍早（E8.5），EphrinB2/EphB4不對稱分布于動(dòng)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 ，提示EphrinB2/EphB4參與原始血管動(dòng)靜脈分化[2-3]。在成年動(dòng)物血管上，EphrinB2、EphB4分別分布于動(dòng)脈、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞[4]，并分別維持著成年動(dòng)物動(dòng)靜脈的結(jié)構(gòu)及功能穩(wěn)定，是動(dòng)靜脈的分子指紋。

1.1 EphrinB2/EphB4的表達(dá)調(diào)控

發(fā)育生物學(xué)研究結(jié)果提示：決定EphrinB2/EphB4恰當(dāng)表達(dá)，進(jìn)而決定動(dòng)靜脈分化的上游因素可能是Notch信號途徑，血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）部分或主要參與了Notch途徑的激活[5]。在動(dòng)脈成血管細(xì)胞前體中，VEGF-A/VEGF-R2與neuropilin-1（NRP1）形成復(fù)合物激活Notch信號，但VEGF-A/VEGF-R2/NRP1復(fù)合物的形成機(jī)制尚不明確，SOXF轉(zhuǎn)錄因子又與RBPJ蛋白相互作用，活化Notch，VEGF通過ETS家族轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)Notch的關(guān)鍵配體Delta-like 4（Dll4），通過Delta-Notch途徑誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物EphrinB2的產(chǎn)生，促進(jìn)動(dòng)脈分化[6-7]（圖1A）。Sturtzel等[8]在斑馬魚模型中研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子FOXF1上調(diào)VEGFR-2和EphrinB2，這進(jìn)一步說明Notch2、VEGFR-2和EphrinB2是FOXF1功能的下游介質(zhì)。 在靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，雞卵清蛋白上游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子II（chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor，COUP-TFII）通過抑制VEGF-A/VEGF-R2/NRP1復(fù)合物中的NRP1、Jagged-1和Notch信號分子的表達(dá)而誘導(dǎo)生成EphB4，但抑制EphrinB2的表達(dá)，Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，抑制靜脈內(nèi)皮COUP-TFII表達(dá)后，靜脈內(nèi)皮上表達(dá)動(dòng)脈標(biāo)志物EphrinB2，靜脈逐漸出現(xiàn)動(dòng)脈表型。VEGF下調(diào)EphB4和上調(diào)DII4都是通過MEK/ERK信號調(diào)控的，并不通過PI3K/Akt信號調(diào)控，PI3K-Akt通路通過抑制ERK/MAPK通路，積極促進(jìn)靜脈分化[10]（圖1B）。在內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）特異性缺失SMAD4的小鼠和魚類中，Neal等[11]證明SMAD4在獲得靜脈而非動(dòng)脈特性時(shí)是必需的，另外在ECs中識別出一種包含必需SMAD結(jié)合基序和SMAD1/5結(jié)合的靜脈內(nèi)皮特異性增強(qiáng)因子，結(jié)果表明，靜脈基因通過BMP/ALK3/SMAD1/5信號級聯(lián)直接轉(zhuǎn)錄激活，再次支持了內(nèi)皮祖細(xì)胞在發(fā)育早期就獲得獨(dú)立信號通路決定下游的動(dòng)靜脈分化。

1.2 VEGF-R2介導(dǎo)的信號通路

圖1 EphrinB2/EphB4的表達(dá)調(diào)控與動(dòng)靜脈分化Figure 1 The expression of EphrinB2/EphB4 and arteriovenous differentiation

目前已知與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能有關(guān)的VEGF-R2下游傳導(dǎo)通路主要為3條：⑴ PLCγ-ERK1/2-RAF1-MEK-ERK1/2。該途徑在血管發(fā)育和成年動(dòng)脈生成具有核心作用[12]，VEGFR2 Y1173磷酸化后結(jié)合并激活PLCγ，促進(jìn)三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-trisphosphate，IP3）和二酰甘油（diacylglycerol，DAG）的生成，IP3從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣,支持依賴Ca2+的DAG誘導(dǎo)激活蛋白激酶Cβ2（PKCβ2），然后調(diào)節(jié)RAF1-MEK-ERK1/2級聯(lián)反應(yīng)，這一途徑繞過了RTK誘導(dǎo)RAS激活的RAF1-MEK-ERK1/2級聯(lián)反應(yīng)[13]。⑵ PI3K-AktmTOR通路，是內(nèi)皮細(xì)胞存活、血管運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)和屏障功能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵通路[14]。⑶ SRC和小GTPases參與內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)、遷移和極化，以及內(nèi)皮細(xì)胞間的連接和血管屏障功能的調(diào)節(jié)[15]。除此之外，VEGF-R2還激活了p38 MAPK、STATs和G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）依賴性信號分子。Sturtzel等[8]在斑馬魚模型中研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子FOXF1上調(diào)VEGFR-2和EphrinB2，而下調(diào)靜脈標(biāo)志物EphB4的表達(dá)，這進(jìn)一步說明Notch2、VEGFR-2和EphrinB2是FOXF1功能的下游介質(zhì)。

2 動(dòng)靜脈內(nèi)膜特異性增生與EphrinB2/EphB4的相互作用

ECs損傷是血管內(nèi)膜增生的病理基礎(chǔ)，ECs損傷后通過產(chǎn)生多種血管活性物質(zhì)作用于血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs），促進(jìn)VSMCs的表型轉(zhuǎn)換而加劇內(nèi)膜增生，EphB4/EphrinB2的相互作用與這一過程密切相關(guān)。EphB4的特異性配體EphrinB2與其他可溶性配體不同，兩者均為跨膜蛋白，由糖基化細(xì)胞外域，跨膜區(qū)和胞內(nèi)域組成，所以EphB4與EphrinB2之間相互作用調(diào)節(jié)血管生成，是通過細(xì)胞-細(xì)胞相互接觸而完成的，兩者可互為配體激活對方，目前大量研究認(rèn)為以EphrinB2為配體激活EphB4為正向信號；反之以EphB4為配體激活EphrinB2為反向信號。

2.1 靜脈分子指紋EphB4激活后的正向信號通路

以EphrinB2為配體刺激EphB4磷酸化而激活系列下游信號通路，可誘導(dǎo)EC的遷移和增殖，其中下游信號分子PI3K/Akt共同作用于遷移和增殖過程，但在Akt后產(chǎn)生差異[16]。

PI3K/Akt-eNOs/NO通路為EphB4介導(dǎo)的ECs遷移的經(jīng)典途徑，NO的下游信號通路可能是通過局灶性黏附激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）傳導(dǎo)[17-18]。Steinle等[16]研究表明，PI3K/Akt-NFκB-MMP級聯(lián)也可能參與EphB4介導(dǎo)的ECs遷移，在EphrinB2/Fc誘導(dǎo)MM1細(xì)胞遷移中，EphB4陽性內(nèi)皮細(xì)胞的PI3K/Akt信號通路被激活，隨之基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinases 2，MMP-2）和MMP-9被激活并發(fā)揮作用，其機(jī)制為MMP-9在其啟動(dòng)子中有一個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，激活的Akt增加了NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而活化MMP-2和MMP-9[19-20]。

EphB4介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖主要通過PI3K/Akt-eNOs/NO-cGMP/PKG-Raf/MEK/MAPK通路進(jìn)行調(diào)控[16,21-22]。研究顯示，Akt能特異性地使內(nèi)皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthases，eNOS）磷酸化，增加亞硝酸鹽的產(chǎn)生，從而激活cGMP-PKG信號通路[23-24]。在Steinle等[16]研究中，使用PI3K、Akt、PKG、MEK的阻斷劑后，由EphrinB2-Fc誘導(dǎo)正向信號引起的內(nèi)皮細(xì)胞增殖受到抑制。

研究[25]用EphrinB2-Fc處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），MEK/ERK通路受到抑制，p120RasGAP參與該通路的介導(dǎo)；但在乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞中，MCF7細(xì)胞在蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶2A（protein serine/threonine phosphatase 2A，PP2A）參與下Ras/ERK通路被激活。Adams等[26]同樣發(fā)現(xiàn)PP2A的亞單位AbαC與ABδC通過作用于Raf1下游及MEK1/2上游而正向調(diào)控Raf1-MEK1/2-ERK1/2通路，出現(xiàn)這樣的差異可能是不同細(xì)胞之間對同一分子的不同反應(yīng)。另外，當(dāng)在EphrinB2-Fc刺激下，靜脈分子指紋EphB4的持續(xù)表達(dá)也同樣可能通過ERK1/2途徑影響內(nèi)皮細(xì)胞的遷移功能而影響移植靜脈重塑[27-28]。Cao等[29]通過共同培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，HBMSCs）和HUVECs發(fā)現(xiàn)EphrinB2和Ephs介導(dǎo)的雙向信號通路通過激活PI3K/AKT/mTOR通路，促進(jìn)HUVECs血管生成，維持HBMSCs自分泌，促進(jìn)骨缺損修復(fù)。而當(dāng)EphrinB2或EphB4的敲低后會顯著抑制內(nèi)皮發(fā)芽，導(dǎo)致毛細(xì)血管芽減少，血管生成減少[30]。

2.2 動(dòng)脈分子指紋EphrinB2激活后的反向信號通路

激活EphrinB2反向信號可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移、趨化、毛細(xì)血管網(wǎng)形成和血管新生，與EphB4激活的正向信號不同的是，由于缺乏內(nèi)在催化活性，EphrinB2介導(dǎo)的反向信號依賴于募集信號分子[31]。EphrinB2胞內(nèi)區(qū)有5個(gè)保守的酪氨酸殘基和C端的PDZ結(jié)合域，其特有的結(jié)構(gòu)提示EphrinB2可能通過酪氨酸磷酸化依賴和 PDZ 結(jié)合結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)2種方式向胞內(nèi)傳遞信號[32-33]。

以EphB4為配體結(jié)合EphrinB2，快速募集Src家族激酶SFKs到EphrinB2附近，使EphrinB2酪氨酸殘基磷酸化，然后與接頭蛋白Grb4的SH2/SH3結(jié)構(gòu)域以及轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3相結(jié)合激活下游信號通路[34-35]，EphrinB-Grb4復(fù)合物可激活FAK催化活性，并招募G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白（GIT）1；Grb4還可通過SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合原癌基因c-CbI相關(guān)蛋白（CAP）、Abi相互作用蛋白（Abi-1）、Axin蛋白、動(dòng)力蛋白（dynamin）、核內(nèi)不均一核糖核蛋白體K（hnRNPK）、及p21活性蛋白激酶（Pak1）等下游信號分子，介導(dǎo)ECs的遷移[36-37]。STAT3與EphrinB結(jié)合后，JAK-2磷酸化并遷移至細(xì)胞核，在細(xì)胞核中調(diào)節(jié)多種靶基因，從而調(diào)控ECs的構(gòu)成[38]。另外，Salvucci等[39]研究發(fā)現(xiàn)EphrinB2/STAT1/JNK3信號通路對玻璃體血管的重構(gòu)至關(guān)重要，JNK3活化能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而EphrinB2通過招募SHP2維持內(nèi)皮細(xì)胞活力，SHP2使STAT1去磷酸化，進(jìn)而抑制JNK3活性，減少促凋亡信號的產(chǎn)生。

PDZ結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)EphrinB2反向信號可能與含PDZ結(jié)合基序的蛋白質(zhì)被募集到PDZ結(jié)構(gòu)域有關(guān)。Ephrin/Eph反向信號通路與VEGFR通路交叉，EphrinB2可通過PDZ相互作用上調(diào)VEGFR2，而不依賴于誘導(dǎo)酪氨酸磷酸化，正向調(diào)控病理性血管生成[33,40]，Warren等[41]發(fā)現(xiàn)，PDZ結(jié)合域的缺失在生理和病理?xiàng)l件下使小鼠體內(nèi)血管生成減少。此外，參與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和血管生成的PI3K/AKT/mTOR和MAPK信號通路是VEGFR2介導(dǎo)信號通路的下游靶點(diǎn)，文獻(xiàn)[42]報(bào)道塔斯品堿衍生物12k通過抑制EphrinB2的PDZ結(jié)合基序蛋白PICK1，降低EphrinB2磷酸化水平，從而影響VEGFR2信號通路。另外，在含PDZ的蛋白中，G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（PDZ-RGS3）和蓬亂蛋白2（disheveled-2，Dvl2）的調(diào)控可能與PDZ介導(dǎo)的EphrinB2反向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，PDZ-RGS3可能通過調(diào)節(jié)G蛋白信號通路部分介導(dǎo)EphrinB2反向信號通路，但下游效應(yīng)蛋白目前尚不清楚[43]。

動(dòng)靜脈分子指紋EphrinB2/EphB4信號通路與生物學(xué)功能詳見表1所示。

表1 動(dòng)靜脈分子指紋EphrinB2/EphB4信號通路與生物學(xué)功能Table 1 The signaling pathways and biological functions of molecular fingerprints EphrinB2/EphB4

3 總結(jié)與展望

綜上所述，在靜脈特異性內(nèi)膜增生中VEGF-A/VEGF-R2/NRP1/COUP-TFII途徑主要參與靜脈分子指紋EphB4的表達(dá)調(diào)控，BMP/ALK3/SMAD1/5信號級聯(lián)也可直接轉(zhuǎn)錄激活EphB4。以EphB4受體激活產(chǎn)生的正向信號，通過PI3K/AkteNOs/NO-FAK以及PI3K/Akt-NF-κB-MMP途徑促進(jìn)ECs遷移；PI3K/Akt-eNOs/NO-cGMP/PKGRaf/MEK/MAPK通路調(diào)控ECs增殖，此外PI3KAkt-mTOR通路，也是ECs存活、血管運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)和屏障功能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵通路。在動(dòng)脈特異性內(nèi)膜增生中，F(xiàn)OX1/VEGF-A/VEGF-R2/NRP1/PI3K-Akt/Dll4-Notch/RBPJ/EphrinB2途徑主要參與EphrinB2的表達(dá)調(diào)控，以EphB4為配體結(jié)合EphrinB2后可能通過酪氨酸磷酸化依賴和 PDZ 結(jié)合結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)2種方式向胞內(nèi)傳遞反向信號，調(diào)控血管生成與重構(gòu)。盡管與VEGF、EphB4、EphrinB2相關(guān)的信號通路研究較為成熟，但VEGF家族中其它因子之間的相互作用以及Eph家族中其它成員與血管生成、重構(gòu)的關(guān)系尚未清楚，Ephrin/Eph信號是如何與細(xì)胞骨架和基因轉(zhuǎn)錄相互作用也不明確，兩者信號通路是否會與其他非經(jīng)典途徑相交叉也不得而知。對于在臨床上的應(yīng)用，更多也是的集中于腫瘤的抗血管生成治療[44]以及骨缺損修復(fù)治療，對于血管術(shù)后再狹窄的治療并不如預(yù)期廣泛，若能從動(dòng)靜脈特異性內(nèi)膜增生信號通路上的異同出發(fā)，將動(dòng)脈與靜脈內(nèi)膜增生區(qū)別開，針對性地阻斷其中的信號通路，從而更好地解決動(dòng)脈或靜脈損傷后的再狹窄問題。