馬哲貴，游 瓊

（1.江西九州檢測(cè)檢驗(yàn)有限公司；2.江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心）

小規(guī)模豬場(chǎng)和農(nóng)戶散養(yǎng)是我國(guó)傳統(tǒng)生豬養(yǎng)殖模式，獸藥被養(yǎng)殖戶用于防治疾病、促進(jìn)生長(zhǎng)、降低死亡率。但是，不遵循休藥期、獸藥濫用等，生豬體內(nèi)大量殘留藥物及其代謝物，這些具有大量藥物殘留的生豬一旦流入市場(chǎng)，人們吃了這樣的豬肉，會(huì)給人們身體健康帶來(lái)嚴(yán)重危害。大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、皮糖質(zhì)激素類、β-內(nèi)酰胺類、硝基咪唑類和喹諾酮類這6種是最常用的獸藥，而且很容易被濫用的獸藥，國(guó)家235號(hào)公告對(duì)這些獸藥進(jìn)行了最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[1]。因此，要研究實(shí)踐快速檢測(cè)方法對(duì)豬肉獸藥殘留進(jìn)行有效檢測(cè)。

目前，國(guó)標(biāo)方法[2-6]大部分都是以分類檢測(cè)為主，優(yōu)點(diǎn)是樣品前處理適用范圍廣，缺點(diǎn)是一個(gè)樣本要進(jìn)行多次檢測(cè)，這就需要投入大量資金和人員。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高效選擇、靈敏度等優(yōu)勢(shì)，在獸藥殘留分析中被廣泛應(yīng)用，但在豬肉中同時(shí)檢測(cè)硝基咪唑類、β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、糖皮質(zhì)類激素和喹諾酮類6類獸藥還鮮有報(bào)道。QuEChERS方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、樣品用量少、試劑消耗少等特點(diǎn)，獸藥殘留檢測(cè)時(shí)被廣泛運(yùn)用。本研究運(yùn)用改良的QuEChERS方法對(duì)豬肉樣品進(jìn)行提取、凈化，可以同時(shí)有效檢測(cè)豬肉樣品中6類22種獸藥殘留。與國(guó)標(biāo)方法比較，本研究所用方法檢查更加快速、操作更簡(jiǎn)單、使用成本更低，建議廣泛運(yùn)用到豬肉獸藥殘留檢測(cè)實(shí)踐中。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn)的6460C型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧離子（ESI）源；湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)的H2100R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；美國(guó)Millipore公司生產(chǎn)的Milli-Q超純水儀。

22種獸藥標(biāo)準(zhǔn)引進(jìn)德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司（見表1）；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，購(gòu)自Honeywell公司；甲酸(色譜純)，購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；吸附劑NH2購(gòu)自日本島津公司；吸附劑C18，購(gòu)自美國(guó)安捷倫公司；乙二胺四乙酸二鈉、無(wú)水硫酸鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、氫氧化鈉均為分析純，購(gòu)自廣東汕頭市西隴化工廠；水是超純水。

Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液：磷酸二氫鈉10.9g，檸檬酸12.9g，乙二胺四乙酸二鈉37.2g，用水溶解，定容至1L（溶液PH值約4.0）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取一定量的獸藥標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇進(jìn)行溶解，定容成1g/L質(zhì)量濃度的單標(biāo)儲(chǔ)備液，置于-18℃環(huán)境中保存。用甲醇將四環(huán)素類儲(chǔ)備液稀釋至100mg/L，其余儲(chǔ)備液稀釋至10mg/L作為混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，檢測(cè)時(shí)根據(jù)需要取用。使用時(shí)需要用0.1%甲酸水-乙腈（90：10，v/v)進(jìn)行逐級(jí)稀釋配制成新鮮的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品處理

分取均質(zhì)樣品2.0g（精確到0.1g），放置于50mL離心管中，將0.1moL/L Na2EDTA-Mcllvaine的緩沖液0.5mL加入其中，使用渦旋將其混勻。再加入乙腈6mL，使用渦旋（10000r/min）混勻5min，然后再用4000r/min的速度離心5min，準(zhǔn)確移取上清液1.0mL至另一5mL離心管。加入混合凈化劑（250mgNa2SO4+50mgC18+50mgNH2），渦旋30s，然后用15000r/min的速度離心10min。準(zhǔn)確移取0.3mL上清液，加入0.7mL水進(jìn)行稀釋，混合均勻之后用0.22μm 有機(jī)微孔濾膜進(jìn)行過濾，用LC-MS/MS測(cè)定濾液。

表1 22種獸藥的質(zhì)譜采集參數(shù)、定量限及相關(guān)系數(shù)

1.4 儀器分析條件

液相條件：流速：0.3mL/min；色譜柱：ZORBAX C18 (2.1mm850mm，1.8μm)，流動(dòng)相A：0.1%（v/v)甲酸-水，流動(dòng)相B：0.1%（v/v)甲酸-乙腈；梯度洗脫：0～1min，5%B；1～3min，5%B～55%B；3～6min，55%B～75%B；6～6.5min，75%B～95%B；6.5～7.0min，95%B；7.0～7.01min，95%B～5%B；7.01～10min，5%B。柱溫：35℃，進(jìn)樣量：5μL。

質(zhì)譜條件：多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）；電噴霧離子（ESI）源；正離子掃描；干燥氣流速5L/min，干燥氣溫度350℃，毛細(xì)管電壓4000V，噴霧器溫度壓力45psi；多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）離子對(duì)，質(zhì)譜采集參數(shù)和保留時(shí)間見表1。其中，以兩對(duì)MRM離子對(duì)和化合物的色譜保留時(shí)間進(jìn)行定性，定量MRM 離子對(duì)的峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理過程的確定

在質(zhì)譜MRM模式下，樣品基質(zhì)的雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾較小，而且色譜柱具有一定的分離凈化功能，可以保障極性較強(qiáng)的雜質(zhì)在1min之前在質(zhì)譜儀之外被洗脫，因此在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，考慮采用較為經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單的液-液分配方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

2.1.1 提取液的選擇

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7-9]設(shè)定樣品前處理?xiàng)l件，本文分別考察了以2%（v/v)甲酸-乙腈、甲醇、乙腈，0.1moL/L的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液-乙腈溶液提取作為提取液的提取效果，有機(jī)溶劑如乙腈、甲醇具有良好的沉淀蛋白質(zhì)和提取目標(biāo)化合物的能力，但是使用甲醇會(huì)將極性基質(zhì)干擾物更多的帶入，增加后續(xù)凈化的難度。用乙腈、2%（v/v)甲酸-乙腈進(jìn)行提取，可以有效將大部分化合物提取出去，但四環(huán)素類化合物回收率僅20%～30%，在0.1moL/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液-乙腈混合溶液提取時(shí)，6類獸藥的回收率都能滿足要。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)摸索，本研究最終確定稱樣2.00g時(shí)，加50L0.1moL/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，渦旋混合30S，然后加6mL乙腈渦旋提取。

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化

通過對(duì)中性氧化鋁、NH2、C18和PSA這4種吸附劑對(duì)比，PSA和中性氧化鋁對(duì)四環(huán)素類、喹諾酮類化合物均有不用程度的吸附效果，但凈化性能較差，干擾峰多；C18和NH2這兩種吸附劑的凈化效果相差不大，協(xié)同使用凈化效果比較理想。試驗(yàn)通過協(xié)同使用和單獨(dú)使用C18和NH2這兩種吸附劑，比較不同的用量（50、100、200mg）下的凈化效果，結(jié)果表明：使用50mgNH2與50mgC18的組合能夠起到良好的凈化效果，且不會(huì)對(duì)待測(cè)物產(chǎn)生明顯的吸附。因此，本研究確定C18和NH2的用量為50mg。

無(wú)水MgSO4與無(wú)水Na2SO4一般作為QuEChERS方法常用的脫水劑，本試驗(yàn)將無(wú)水MgSO4加入提取液中，結(jié)果證實(shí)喹諾酮類和四環(huán)素類的回收率在一定程度上有所降低，特別是四環(huán)素類的回收率有非常明顯的下降，而無(wú)水Na2SO4影響不明顯。原因在于四環(huán)素類藥物容易和Mg2+產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)形成螯合物。經(jīng)過反復(fù)多次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)無(wú)水Na2SO4的加入量在250mg時(shí)試驗(yàn)效果最佳。

2.2 色譜條件優(yōu)化

本研究的有機(jī)相采用乙腈，試驗(yàn)考察了水相中，添加5mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸對(duì)質(zhì)譜靈敏度與色譜分離的影響。試驗(yàn)結(jié)果證明：添加乙酸銨后，四環(huán)素類峰形效果較差，且靈敏度下降比較明顯；添加甲酸后，各目標(biāo)化合物具有了更高效的離子化效率，峰形明顯改善，靈敏度普遍較好。

將0.1%的甲酸加入乙腈中，各化合物具有更強(qiáng)的響應(yīng)信號(hào)，重復(fù)性和分離度效果更加良好，并且明顯降低了基線噪音。因此，本試驗(yàn)最終的流動(dòng)相選取的是：0.1%甲酸-乙腈-0.1%甲酸水溶液。運(yùn)用選定的色譜柱和流動(dòng)相，對(duì)洗脫程序進(jìn)行有效梯度優(yōu)化，將所有檢測(cè)物的靈敏度和峰形調(diào)整到最佳。

2.3 方法線性范圍、定量限和加標(biāo)回收

本研究為了有效消除標(biāo)準(zhǔn)曲線的基質(zhì)效應(yīng)，應(yīng)用基質(zhì)空白溶液配制。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：橫坐標(biāo)為各組分的質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為各色譜峰面積，相關(guān)系數(shù)見表1。各個(gè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（關(guān)系數(shù)為0.992～0.999）。定量限：信噪比≥10，22種獸藥的定量限為4～25μg/kg。

選取樣品為陰性豬肉，添加標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)按1、2、10倍檢出限的水平濃度進(jìn)行，一式3份，渦旋1min，然后靜置30min，之后按照“1.3”的步驟方法進(jìn)行處理，按照“1.4”的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，通過各組的峰面積對(duì)加標(biāo)回收率進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果22種化合物3各不同濃度添加水平，回收率在65%～105%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，整體回收率水平符合食品檢測(cè)的要求。

3 結(jié)論

本研究采用改進(jìn)的QuEChERS方法建立了LC-MS/M S同時(shí)測(cè)定豬肉中硝基咪唑類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、糖皮質(zhì)類激素、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類6類22種獸藥的多殘留快速分析方法。分別對(duì)提取溶液、凈化方法、吸附劑的選擇、色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)作比較，該方法有效節(jié)約了檢測(cè)的成本、縮短了檢測(cè)時(shí)間周期。本方法監(jiān)測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、凈化效果好，回收率和靈敏度等符合多殘留檢測(cè)技術(shù)的要求。為各食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供了快速、簡(jiǎn)單的篩查方法，在日常對(duì)豬肉的禁限用獸藥監(jiān)控中可以大批量的有效監(jiān)測(cè)。