謝東梅 徐 丹 任 丹

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

抗菌包裝可通過與食品表面接觸發(fā)揮抗菌作用，達(dá)到抑制食品在貯藏過程中的微生物生長(zhǎng)，延緩腐爛變質(zhì)并避免二次污染的目的。因此，抗菌包裝的應(yīng)用可有效防止食品在流通和銷售過程中的微生物污染，延長(zhǎng)食品的貨架期，還可大大減少食品加工過程中化學(xué)添加劑的用量，并盡可能地保持食品的品質(zhì)，增強(qiáng)食品的安全性，因此成為目前食品包裝材料的研究熱點(diǎn)之一。目前的抗菌包裝材料大多是通過添加一定的抗菌劑，賦予其抗菌能力。納米銀(AgNPs)因其優(yōu)異的抗菌性能和良好的安全性，成為醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域最有應(yīng)用潛力的抗菌填料之一[1]。已有研究表明，含AgNPs的保鮮膜可有效延長(zhǎng)雞蛋的貨架期[2]，保持黃瓜的貯藏品質(zhì)[3]，抑制南豐蜜桔果實(shí)霉菌的生長(zhǎng)[4]，以及延長(zhǎng)冷藏蝦仁的保質(zhì)期[5]等。但AgNPs尺寸較小，易發(fā)生遷移而導(dǎo)致安全隱患。如能將其進(jìn)行固載或與其他材料復(fù)合則可降低其安全風(fēng)險(xiǎn)。

石墨烯(Graphene)因其絕佳的機(jī)械性能、耐熱性和巨大的比表面積等優(yōu)良性能被譽(yù)為21世紀(jì)“革命性材料”。將其加入有機(jī)高分子材料中，可大大增強(qiáng)高分子材料的力學(xué)性能、阻隔性和耐熱性。而氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)含有大量的—OH和—COOH等含氧基團(tuán)，可通過物理吸附、靜電引力和電荷轉(zhuǎn)移等相互作用吸附和固載Ag+，并通過還原劑將其還原為納米銀粒子(AgNPs)固載于GO片層表面，從而有效減少顆粒的遷移[6]，并可有效地抑制石墨烯在高分子基材中的團(tuán)聚[7]，使其更好地發(fā)揮納米增強(qiáng)作用。

采用天然還原劑如植物提取物等來制備納米粒子及其復(fù)合物具有綠色安全等優(yōu)點(diǎn)[8]，尤其適用于醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的納米粒子的合成。例如采用慈姑(Syzygiumcumini)種子提取物合成納米金裝飾的還原氧化石墨烯(rGO)[9]，采用松樹葉提取液合成納米銀裝飾的rGO[10]等都已被報(bào)道過。而橘皮作為世界主要水果之一柑橘的主要副產(chǎn)物，含有豐富的類黃酮、酚酸和VC等還原性成分，是優(yōu)良的天然還原劑之一。但尚未有報(bào)道采用橘皮提取物來合成納米銀和石墨烯的復(fù)合物。本課題組[11]前期采用橘皮提取液成功合成了納米銀，并對(duì)橘皮種類進(jìn)行了篩選。在此基礎(chǔ)上，本研究擬采用澳橙果皮提取液作為還原劑及穩(wěn)定劑，制備載銀石墨烯(rGO-Ag)。通過單因素試驗(yàn)探究反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和AgNO3濃度對(duì)rGO-Ag反應(yīng)率、粒徑大小及穩(wěn)定性的影響。由此設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以平均粒徑作為考察指標(biāo)，確定澳橙果皮提取液合成rGO-Ag的最優(yōu)工藝，并對(duì)rGO-Ag的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以期為rGO-Ag在抗菌包裝中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮澳橙(Citrussinensis)：重慶市北碚區(qū)永輝超市；

石墨粉：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

濃硫酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)、濃鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)37%)：優(yōu)級(jí)純，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；

雙氧水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%)、硝酸銀、氫氧化鈉、高錳酸鉀、硝酸鈉、檸檬酸三鈉：分析純，成都科龍化工試劑廠；

超純水：實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)：LGJ-10型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；

冷凍離心機(jī)：Avanti-J-301型，美國(guó)貝克曼庫爾特公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-2450型，日本島津公司；

馬爾文粒度儀：Nano-ZS90型，英國(guó)馬爾文公司；

透射電子顯微鏡(TEM)：JEM-1200EX型，日本電子公司；

傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)：Spectrun100型，美國(guó)Perkinelmer公司；

激光共聚焦顯微拉曼(Raman)光譜儀：Scientific DXR2型，美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 果皮提取液的制備 將新鮮的澳橙洗凈晾干，果皮剝下切成小塊，裝于自封袋中，置于-20 ℃冰箱冷藏備用。取50 g冷藏橙皮加入到300 mL超純水中，用榨汁機(jī)打碎后倒入1 000 mL燒杯中，95 ℃水浴中攪拌20 min。冷卻后用紗布過濾，去除橙皮渣。再將濾液以6 000 r/min 離心10 min。上清液抽濾以進(jìn)一步去除提取液中的細(xì)小橙皮渣。制得的橙皮提取液置于4 ℃冰箱內(nèi)待用。

1.2.2 GO的制備 參照改進(jìn)的Hummers方法[12]。步驟如下：將2 g硝酸鈉、2 g石墨粉和95 mL 98%濃硫酸添加到1 000 mL圓底燒瓶中混合后，超聲波處理1 h。在冰水浴條件下800 r/min攪拌2 h。然后緩慢添加12 g高錳酸鉀并在45 ℃水浴中繼續(xù)攪拌2 h，再緩慢加入100 mL 超純水。將混合液冷卻10 h后，緩慢加入50 mL 30%過氧化氫溶液。自然冷卻后，將所得混合物先用5%稀鹽酸溶液多次離心清洗，再用超純水反復(fù)離心清洗，直至離心所得上清液為中性。離心所得固體即為GO，用超純水溶解后超聲波處理2 h。標(biāo)定GO濃度(6.8 mg/mL)后，置于冰箱4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 rGO-Ag的合成 向150 mL錐形瓶中分別加入30 mL橙皮提取液，1 mL稀釋至68 mg/LGO和1 mL 0.01 mol/L 檸檬酸鈉，再加入20 mL一定濃度AgNO3溶液以及28 mL超純水。超聲0.5 h后，在不同溫度下反應(yīng)一定時(shí)間。待冷卻后，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，將所得沉淀冷凍干燥(真空度<10 Pa，冷阱溫度<-50 ℃)，即為rGO-Ag。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 反應(yīng)時(shí)間：以AgNO3濃度10 mmol/L，油浴溫度90 ℃為基礎(chǔ)條件。考察反應(yīng)時(shí)間(1，2，3，4，5，6 h)對(duì)rGO-Ag反應(yīng)率、粒徑大小及穩(wěn)定性的影響。

(2) 反應(yīng)溫度：以AgNO3濃度10 mmol/L，反應(yīng)時(shí)間4 h為基礎(chǔ)條件?？疾煊驮囟?70，80，90，100 ℃)對(duì)rGO-Ag反應(yīng)率、粒徑大小及穩(wěn)定性的影響。

(3) AgNO3濃度：以反應(yīng)時(shí)間4 h，油浴溫度100 ℃為基礎(chǔ)條件，考察AgNO3濃度(5，10，15，20，25，30 mmol/L)對(duì)rGO-Ag反應(yīng)率、粒徑大小及穩(wěn)定性的影響。

1.2.5 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取反應(yīng)時(shí)間、溫度、AgNO3濃度3個(gè)因素中的4個(gè)水平，以反應(yīng)后稀釋相同倍數(shù)反應(yīng)液的平均粒徑作考察指標(biāo)，采用L16(45)的正交試驗(yàn)表頭設(shè)計(jì)，以確定橙皮提取液還原制備rGO-Ag的最優(yōu)條件。

1.2.6 rGO-Ag的表征

(1) 紫外—可見光譜測(cè)定：取適量用超純水稀釋后的rGO-Ag反應(yīng)溶液于石英比色皿中，采用UV-2450紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，波長(zhǎng)范圍200～800 nm。

(2) 粒徑和Zeta電位測(cè)定：取1 mL超純水稀釋后的rGO-Ag反應(yīng)溶液于粒徑樣品池中，用馬爾文激光粒度儀測(cè)定rGO-Ag平均粒度值。另取上述稀釋液1 mL至Zeta電位樣品池中，測(cè)定溶液Zeta電位值。

(3) TEM分析：將少量GO、rGO及最優(yōu)工藝條件制備得到的rGO-Ag粉末置于無水乙醇中，采用細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行高頻超聲分散，然后滴至銅網(wǎng)上，采用TEM對(duì)樣品的表面形貌進(jìn)行觀察，并使用Image-ProPlus 6.0軟件分析和統(tǒng)計(jì)rGO上負(fù)載的AgNPs的粒徑大小。

(4) Raman光譜測(cè)定：取少量rGO、GO及最優(yōu)工藝條件制備得到的rGO-Ag粉末分別置于載玻片上，將其壓實(shí)后，利用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀在室溫下進(jìn)行Raman光譜測(cè)試。掃描波數(shù)范圍50～2 500 cm-1，激發(fā)波長(zhǎng)532 nm。

(5) FTIR光譜測(cè)定：將橙皮提取液、GO、AgNPs及最優(yōu)工藝條件制備得到的rGO-Ag進(jìn)行冷凍干燥得到粉末，采用KBr壓片法制備樣品，掃描波數(shù)范圍400～4 000 cm-1，分辨率2 cm-1，掃描次數(shù)32次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均用Origin Pro 8.6作圖，采用SPSS 18進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間的影響 由圖1(a)可知，rGO-Ag在430 nm 左右有1個(gè)明顯的吸收峰，與AgNPs表面等離子體共振峰一致[13]。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，該吸收峰的峰值不斷增加，表明溶液中AgNPs濃度逐漸升高，反應(yīng)率逐漸提高。但反應(yīng)時(shí)間超過4 h后，增加速度減緩，說明反應(yīng)逐漸達(dá)到飽和[10]。

由圖1(b)可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從1 h增加至4 h時(shí)，rGO-Ag的平均粒徑降低了41.2%。此時(shí)繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，平均粒徑仍呈下降趨勢(shì)，但下降不明顯?？赡苁欠磻?yīng)初期rGO尚未被完全分散，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，rGO上附著的AgNPs逐漸增多，且吸附了橙皮提取液中的果膠，使得生成的rGO-Ag能更好地分散，粒徑減小[7, 9, 14]。納米分散液的Zeta電位絕對(duì)值是衡量其在溶液中穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)。通常情況，當(dāng)其絕對(duì)值高于30 mV，則認(rèn)為該分散體系非常穩(wěn)定[15]。rGO-Ag的Zeta電位為負(fù)值，表明其表面帶負(fù)電荷，且絕對(duì)值均分布在25～27 mV，表明其在水相中能較為穩(wěn)定地分散。同時(shí)，反應(yīng)時(shí)間對(duì)rGO-Ag溶液的穩(wěn)定性影響較小。

2.1.2 反應(yīng)溫度的影響 由圖2(a)可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，rGO-Ag在430 nm處吸收峰的強(qiáng)度明顯增加，說明反應(yīng)溫度對(duì)AgNPs的反應(yīng)率有較大影響。且由圖2(b) 可知，提高反應(yīng)溫度可顯著降低rGO-Ag的平均粒徑?？赡苁巧邷囟瓤杉涌旆磻?yīng)速率[16]，并有利于AgNPs晶體成核[17]。但隨著反應(yīng)溫度的提高，rGO-Ag溶液的Zeta電位絕對(duì)值略有下降。

大寫字母不同表示Zeta電位絕對(duì)值差異顯著(P<0.05)；小寫字母不同表示平均粒徑差異顯著(P<0.05)

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)rGO-Ag的影響

Figure 1 Effects of reaction time on rGO-Ag

2.1.3 AgNO3濃度的影響 由圖3(a)可知，隨著AgNO3濃度的增加，rGO-Ag在430 nm處的吸收峰值不斷增加。但當(dāng)濃度超過25 mmol/L時(shí)，增速減緩，可能是Ag+濃度過高，導(dǎo)致橙皮提取液中的還原劑大量消耗使其濃度降低。由圖3(b)可知，當(dāng)AgNO3濃度為5～25 mmol/L時(shí)，所得rGO-Ag的平均粒徑均較為穩(wěn)定地分布在240 nm附近。當(dāng)AgNO3濃度為30 mmol/L時(shí)，rGO-Ag的平均粒徑有顯著增加，表明生成的AgNPs開始團(tuán)聚?？赡苁钱?dāng)AgNO3濃度較低時(shí)，晶體生長(zhǎng)速度受限[14]。隨著AgNO3濃度的進(jìn)一步增加，晶體生長(zhǎng)速率增加，當(dāng)其生長(zhǎng)速度大于成核速度時(shí)，粒徑逐漸增大[17]。此外，當(dāng) AgNO3濃度在5～10 mmol/L時(shí)，rGO-Ag溶液的Zeta電位絕對(duì)值變化不顯著。而濃度進(jìn)一步增加時(shí)，溶液的Zeta電位絕對(duì)值則顯著降低。由此可知，AgNO3濃度過高會(huì)降低rGO-Ag溶液的穩(wěn)定性。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定時(shí)間、溫度、AgNO3濃度3個(gè)因素的4個(gè)水平，采用L16(45)的正交試驗(yàn)表頭設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。以反應(yīng)后得到的rGO-Ag平均粒徑大小為考察指標(biāo)，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，所得結(jié)果分別見表2、3。由表2 可知，3個(gè)因素對(duì)rGO-Ag平均粒徑的影響順序?yàn)榉磻?yīng)溫度>反應(yīng)時(shí)間>AgNO3濃度。此外，與代表了試驗(yàn)誤差[18]的空白列極差值相比，反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和AgNO3濃度3個(gè)因素均具有較高的極差值，表明3個(gè)因素的水平效應(yīng)間存在差異。表3中的P值進(jìn)一步驗(yàn)證了上述3個(gè)因素對(duì)rGO-Ag平均粒徑大小的影響作用。因此，由正交試驗(yàn)結(jié)果得出制備rGO-Ag的最佳工藝條件為A4B4C3，即反應(yīng)時(shí)間為4 h，反應(yīng)溫度為100 ℃，AgNO3濃度為25 mmol/L。在此條件下，所得rGO-Ag的平均粒徑為249 nm。

大寫字母不同表示Zeta電位絕對(duì)值差異顯著(P<0.05)；小寫字母不同表示平均粒徑差異顯著(P<0.05)

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)rGO-Ag的影響

Figure 2 Effects of reaction temperature on rGO-Ag

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

大寫字母不同表示Zeta電位絕對(duì)值差異顯著(P<0.05)；小寫字母不同表示平均粒徑差異顯著(P<0.05)

圖3 AgNO3濃度對(duì)rGO-Ag的影響

Figure 3 Effects of AgNO3concentrations on rGO-Ag

2.3 rGO-Ag的結(jié)構(gòu)表征

采用TEM對(duì)GO、rGO和rGO-Ag的微觀形貌進(jìn)行表征。由圖4(a)、(b)可知，GO表面平整、光滑，呈透明薄片狀，而rGO透明度降低，褶皺增加，可能是橙皮提取液中的有機(jī)物附著其上所致。由圖4(c)可觀察到rGO-Ag片層的透明度降低，且表面附著了大量納米尺寸的球形顆粒，表明AgNPs成功負(fù)載到rGO片層上。圖4(d)是根據(jù)TEM圖統(tǒng)計(jì)得出的rGO-Ag上負(fù)載AgNPs的粒徑分布。結(jié)果顯示，AgNPs的尺寸分布范圍為3～50 nm，且有46.3%分布在10～20 nm，平均粒徑為21 nm。

圖5(a)所示的GO、rGO和rGO-Ag的Raman光譜可進(jìn)一步揭示其結(jié)構(gòu)變化。GO的2個(gè)特征峰D、G峰分別出現(xiàn)在1 344，1 593 cm-1。其中，G峰是由sp2雜化的碳原子振動(dòng)產(chǎn)生，對(duì)應(yīng)于布里淵區(qū)中心的E2g聲子[19]。D峰為缺陷峰，由sp3雜化的碳原子振動(dòng)產(chǎn)生，當(dāng)石墨烯片層邊緣的對(duì)稱性被破壞或樣品存在缺陷時(shí)便會(huì)出現(xiàn)。因此，D峰和G峰的強(qiáng)度比(ID/IG)值越大，表明石墨烯的氧化程度越大。由Raman光譜中二者的強(qiáng)度計(jì)算可得，GO、rGO和rGO-Ag的ID/IG值分別為0.88，0.84，0.75。由此表明，GO可被橙皮中的還原成分還原成rGO，結(jié)構(gòu)對(duì)稱性增加。而rGO-Ag的ID/IG值進(jìn)一步減小，可能是由于納米銀粒子的吸附增加了電子碰撞[20]。此外，由于AgNPs的表面增強(qiáng)散射(SERS)，rGO-Ag樣品中D和G帶的峰強(qiáng)度顯著增加[21]。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

表3 方差分析結(jié)果

圖5(b)所示為橙皮提取液、rGO-Ag、GO和AgNPs的FTIR譜圖。GO在1 621，1 724，1 000～1 368 cm-1處出現(xiàn)了特征吸收峰，分別對(duì)應(yīng)于碳骨架上C═C鍵的伸縮振動(dòng)峰、羧酸和羰基中的C═O伸縮振動(dòng)峰，及C—O伸縮振動(dòng)峰[22]。與GO相比，rGO-Ag譜圖中含氧基團(tuán)的吸收峰強(qiáng)度顯著降低，說明其已被還原。且rGO-Ag在1 545，1 454 cm-1與AgNPs的特征吸收峰一致，進(jìn)一步表明AgNPs已成功負(fù)載到rGO上。

圖4 TEM圖及rGO-Ag粒徑分布圖

圖5 Raman圖譜及紅外吸收光譜

3 結(jié)論

本研究以澳橙果皮提取液作為還原劑及穩(wěn)定劑，通過綠色還原法制備了rGO-Ag。單因素試驗(yàn)表明，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間、提高反應(yīng)溫度和適當(dāng)增加AgNO3濃度均可提高AgNPs的反應(yīng)率，降低其平均粒徑。正交試驗(yàn)明確了rGO-Ag平均粒徑的影響因素主次順序?yàn)椋悍磻?yīng)溫度>反應(yīng)時(shí)間>AgNO3濃度，并確定了制備rGO-Ag的最佳工藝條件為反應(yīng)時(shí)間4 h，反應(yīng)溫度100 ℃，AgNO3濃度25 mmol/L。在此工藝條件下，GO可被橙皮提取液還原，且片層上成功負(fù)載了粒徑范圍為3～50 nm AgNPs。后續(xù)研究可將制得的rGO-Ag用作抗菌納米填料，添加到高分子基材中制備納米抗菌包裝材料。