王學(xué)淵 劉靜宜 洪艷平 李雨薇 柯法鈞 陳薪竹 楊武英

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2. 江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

中國江西氣候溫和、雨水充沛，擁有適宜的茶葉生長(zhǎng)自然條件，產(chǎn)出的茶葉品質(zhì)優(yōu)良，其中廬山云霧、遂川狗牯腦、井岡翠綠、上饒白眉、修水寧紅、靖安白茶等均為江西名茶的代表[1]。研究表明茶葉具有良好的抗氧化能力[2-3]，能有效清除自由基并抑制機(jī)體自由基損傷[4-5]，具有抗癌[6]、抗輻射[7-8]、防治疾病[9]和延緩衰老[10]等功能。茶多酚是茶葉中的主要抗氧化物質(zhì)，其含量達(dá)茶葉干重的18%～36%[11]。茶多酚主要包括兒茶素[12]、茶黃素[13]、沒食子酸[14-15]和黃酮等[16]，而其中兒茶素占比最大。目前尚未見對(duì)江西眾多茶葉中的兒茶素及其抗氧化能力進(jìn)行分析的研究。本研究擬選取江西11種名茶作為研究對(duì)象，采用高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分別對(duì)其總兒茶素、兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和兒茶素沒食子酸酯(ECG)進(jìn)行測(cè)定和比較，并采用DPPH自由基清除能力、鐵還原抗氧化能力、ABTS+自由基清除能力、總還原能力4項(xiàng)指標(biāo)對(duì)樣品的體外抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定和比較，旨在了解各種江西名茶中的兒茶素含量差異以及體外抗氧化能力差異，為消費(fèi)者選擇適合的茶葉以及江西茶葉的種植和加工提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶、紅茶、白茶3種類型共11種江西名茶茶葉樣品：江西省南昌市鹿鼎國際茶葉城；

1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)：純度≥97%，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；

乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA、抗環(huán)血酸、乙酸：色譜純，西隴化工股份有限公司；

2,4,6-三吡啶基-S-三嗪(TPTZ)：純度99%，金克隆生物技術(shù)有限公司；

2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)：純度98%，金克隆生物技術(shù)有限公司；

水溶性維生素E標(biāo)準(zhǔn)品(Trolox)、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(C)、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(EC)、表沒食子兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品(EGCG)、兒茶素沒食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品(ECG)：純度≥98%，金克隆生物技術(shù)有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，美國天地有限公司；

超純水：實(shí)驗(yàn)室MILLIPORE超純水機(jī)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

高速多功能粉碎機(jī)：XY-200型，星宇儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：HC-2518R型，杭州華創(chuàng)科學(xué)器材有限公司；

可見分光光度計(jì)：723N型，上海光學(xué)儀器一廠；

高效液相色譜儀：Waters e2695型，美國Waters公司；

循環(huán)水真空泵：SHB-III型，河南省予華儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，常州億通分析儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 兒茶素含量的測(cè)定 參照GB/T 8313—2008采用高效液相色譜法對(duì)11種茶葉中的5種兒茶素含量進(jìn)行測(cè)定。

(1) 色譜條件：色譜柱為Waters Spherisorb C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫35 ℃；流速0.9 mL/min；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)λ=278 nm；進(jìn)樣量10 μL；梯度洗脫程序?yàn)椋?00% A相(90 mL乙腈+20 mL乙酸+2 mL 10 mg/mL EDTA溶液，用超純水定容至1 L，搖勻，過0.45 μm 膜)保持10 min→15 min內(nèi)由100% A相變化至68% A、32% B相(800 mL乙腈+20 mL乙酸+10 mg/mL EDTA溶液2 mL，用超純水定容至1 L，搖勻，過0.45 μm膜)→68% A相、32% B相保持10 min→100% A相。色譜圖見圖1。

圖1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液和茶葉樣品溶液的色譜圖

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：用穩(wěn)定溶液(25 mL 10 mg/mL EDTA溶液+25 mL 10 mg/mL抗壞血酸溶液+50 mL乙腈，用超純水定容至500 mL，搖勻)將EGC、C、EC、EGCG、ECG配置為不同濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)，兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

(3) 精密度試驗(yàn)：分別取5個(gè)不同濃度梯度的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜的工作條件下，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，每個(gè)濃度6次平行，對(duì)結(jié)果進(jìn)行批次內(nèi)差異分析，計(jì)算精密度。

(4) 江西名茶樣品中兒茶素含量的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取11種干燥粉碎過篩的江西名茶樣品各0.2 g于10 mL離心管中，加入預(yù)熱到70 ℃的70%甲醇溶液5 mL，充分?jǐn)嚢杈鶆颍⒖剔D(zhuǎn)移到90 ℃的水浴中，提取10 min，提取結(jié)束后冷卻到室溫，離心10 min(3 500 r/min)，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，殘?jiān)貜?fù)提取離心1次，2次上清液合并定容至同一容量瓶中。用移液管移取2 mL提取液至10 mL容量瓶中，用穩(wěn)定溶液定容，搖勻，過0.45 μm濾膜。進(jìn)樣10 μL，對(duì)11種江西名茶中5種兒茶素的含量進(jìn)行HPLC測(cè)定。

(5) 加標(biāo)回收試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取6份同種茶葉樣品0.2 g 于10 mL離心管中，其中2份做對(duì)照(即不加標(biāo)準(zhǔn)品)，其他4份分為2組，每組加入不同水平的5種兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，每種水平2個(gè)平行樣。第1組(水平1)EGC、C、EC、EGCG、ECG 5種兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品的加入質(zhì)量分別為24.99，12.50，25.38，64.64，60.89 mg；第2組(水平2)的加入質(zhì)量分別為10.00，5.00，9.63，5.43，9.10 mg。樣品處理步驟同1.3.1(4)。按照上述1.3.1(1)高效液相色譜工作條件，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定加標(biāo)和未加標(biāo)茶葉樣品中5種兒茶素的含量。按式(1)計(jì)算加標(biāo)回收率。

(1)

式中：

A——加標(biāo)回收率，%；

A0——未加標(biāo)樣測(cè)定值，mg/g；

A1——加標(biāo)樣測(cè)定值，mg/g；

B——加標(biāo)量，mg/g。

1.3.2 體外抗氧化能力的測(cè)定

(1) 茶葉提取液的制備：準(zhǔn)確稱取各種茶葉各0.400 0 g，置于小燒杯中，加入100 ℃蒸餾水50 mL，浸泡15 min，過濾；濾渣再用相同方法浸泡過濾，2次濾液合并于100 mL容量瓶，用蒸餾水定容，得到茶葉提取液，待進(jìn)一步稀釋。注意避光保存。

(2) 清除DPPH自由基能力：根據(jù)文獻(xiàn)[17]在3只試管中分別加入2 mL DPPH液+2 mL 蒸餾水(S0)、2 mL DPPH液+2 mL不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液(S1)、2 mL無水乙醇+2 mL不同濃度 的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液(S2)，混勻，室溫下置于暗處反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定3組溶液的吸光度(A0、A1、A2)。平行測(cè)定3次，結(jié)果取其平均值。以DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，Trolox濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。將1.3.2(1)中的茶葉提取液稀釋100倍，代替標(biāo)準(zhǔn)品按上述相同步驟進(jìn)行吸光度測(cè)定并按式(2)計(jì)算清除率。

(2)

式中：

DPPH——自由基清除率，%；

A0——空白對(duì)照吸光度；

A1——樣品溶液的吸光度；

A2——抗氧化劑本底吸光度。

(3) 鐵還原抗氧化能力：根據(jù)文獻(xiàn)[18—19]取0.1 mL 不同濃度的FeSO4工作液于試管，加入1.0 mL新鮮配制的 FRAP試劑(由 0.3 mol/L 醋酸鹽緩沖液，10 mmol/L TPTZ 溶液，20 mmol/L FeCl3溶液按體積比 10∶1∶1 組成)，混勻后在37 ℃水浴下反應(yīng)40 min，待冷卻到室溫后，測(cè)定波長(zhǎng) 593 nm 處的吸光度。平行測(cè)定3次，結(jié)果取其平均值。以摩爾濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制硫酸亞鐵抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線。將1.3.2(1)中的茶葉提取液稀釋100倍，代替標(biāo)準(zhǔn)品按上述相同步驟進(jìn)行鐵還原抗氧化能力的測(cè)定。

(4) 清除ABTS+自由基能力：根據(jù)文獻(xiàn)[20—21]取0.1 mL不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管，加入3.9 mL ABTS+反應(yīng)試劑，震搖10 s以充分混勻，室溫靜置6 min，立刻測(cè)734 nm處的吸光值。再以0.1 mL蒸餾水+3.9 mL ABTS+反應(yīng)試劑作為空白對(duì)照組，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A0。平行測(cè)定3次，結(jié)果取其平均值。以 ABTS+自由基清除率為縱坐標(biāo)，以 Trolox 濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。將1.3.2(1)中的茶葉提取液稀釋10倍，代替標(biāo)準(zhǔn)品按上述相同步驟測(cè)定吸光度A1并按式(3)計(jì)算其清除率。

(3)

式中：

ABTS+——自由基清除率，%；

A0——空白對(duì)照組吸光度；

A1——樣品溶液吸光度。

(5) 鐵氰化鉀還原能力：根據(jù)文獻(xiàn)[21]取2 mL稀釋10倍的茶葉提取液于試管，加入磷酸緩沖液(pH=6.6)和1%鐵氰化鉀溶液各2 mL，混勻，置于50 ℃水浴中20 min，迅速冷卻后，加入10%三氯乙酸溶液2 mL?；旌虾?，利用高速冷凍離心機(jī)以3 000 r/min離心10 min，取2 mL上清液，再加入蒸餾水2 mL和0.1% FeCl3溶液0.5 mL，靜置10 min，用蒸餾水為空白，測(cè)定波長(zhǎng)700 nm處的吸光度。平行測(cè)定3次，結(jié)果取其平均值。

1.3.3 11種江西名茶兒茶素含量及體外抗氧化能力比較分析 采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，采用SPSS Statistics 19.0軟件對(duì)不同類型江西名茶兒茶素含量及體外抗氧化能力進(jìn)行差異顯著性比較分析，以P<0.05為顯著性差異水平，以P<0.01為極顯著性差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 11種江西名茶兒茶素含量比較分析

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 各種兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表1所示，由標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2值可知5種兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系都良好，符合要求。

2.1.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，5種兒茶素精密度試驗(yàn)的RSD在0.11%～2.70%，均符合要求。

2.1.3 加標(biāo)回收試驗(yàn) 由表3可知，5種兒茶素的2個(gè)不同添加水平的加標(biāo)回收率在 66.24%～123.20%，說明建立的方法符合要求。

2.1.4 11種江西名茶中兒茶素含量的測(cè)定和比較分析

采用本試驗(yàn)建立的高效液相色譜法對(duì)11種江西名茶中兒茶素的含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表4。由表4可知，11種茶葉中EGC含量婺源毛尖、廬山云霧、井崗翠綠、靖安白茶和資溪白茶與其他6種茶葉相比差異極顯著(P<0.01)，婺源毛尖、廬山云霧和資溪白茶之間差異不顯著，井崗翠綠和靖安白茶跟婺源毛尖、廬山云霧、資溪白茶之間差異極顯著(P<0.01)，修水寧紅、武夷紅茶、祁紅茶、浮紅茶、遂川狗牯腦、浮瑤仙芝之間差異不顯著；C含量靖安白茶與其他10種茶葉比較差異極顯著(P<0.01)，其他10種茶葉中，井崗翠綠相較修水寧紅、武夷紅茶、祁紅茶、浮紅茶、遂川狗牯腦差異顯著(P<0.05)，有的差異不顯著；EC含量靖安白茶和祁紅茶與其他9種茶葉差異極顯著(P<0.01)，其他9種茶葉中，浮紅茶相較修水寧紅、浮瑤仙芝、婺源毛尖、廬山云霧和井崗翠綠差異顯著(P<0.05)，有的差異不顯著；EGCG含量靖安白茶和廬山云霧與其他9種茶葉相比差異極顯著(P<0.01)，其他9種茶葉相比有的差異顯著(P<0.05)有的差異不顯著；ECG含量靖安白茶、井崗翠綠和婺源毛尖與其他8種茶葉相比差異極顯著(P<0.01)，靖安白茶跟井崗翠綠和婺源毛尖相比差異極顯著(P<0.01)，井崗翠綠和婺源毛尖差異不顯著，其他8種茶葉中，廬山云霧與4種紅茶相比差異顯著(P<0.05)有的差異不顯著；總兒茶素含量靖安白茶與其他10種茶葉差異顯著(P<0.05)，除靖安白茶外其他10種茶葉兒茶素含量差異不顯著，可見不同茶葉中各種兒茶素的含量差異不大，綠茶和白茶總兒茶素和各種兒茶素含量總體比紅茶高。

表1 5種兒茶素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表4 11種種江西名茶中兒茶素含量檢測(cè)結(jié)果?

? 同列大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 11種江西名茶體外抗氧化能力比較分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力 將不同種類的茶葉提取液與DPPH溶液反應(yīng)30 min后，反應(yīng)體系顏色變淺，說明茶葉提取液具有清除自由基的能力[22]。茶葉樣品的DPPH自由基清除能力TEAC值(Trolox equivalent antioxidant capacity)以達(dá)到同樣清除率所需Trolox的濃度(mg/L)來表示，TEAC值越大，則對(duì)DPPH自由基清除能力越強(qiáng)。如圖2所示，各種茶葉樣品的TEAC值依次為修水寧紅<浮紅茶<祁紅茶<武夷紅茶<狗牯腦<廬山云霧<靖安白茶<資溪白茶<婺源毛尖<浮瑤仙芝<井崗翠綠；3種類型的茶葉DPPH自由基清除能力總體呈現(xiàn)出紅茶<白茶和綠茶的趨勢(shì)。不同類型茶葉的DPPH自由基清除能力有顯著差異(P<0.01或P<0.05)；同種類型茶葉中，修水寧紅與其他紅茶相較DPPH自由基清除能力有顯著性差異(P<0.01)，2種白茶之間的DPPH自由基清除能力差異顯著(P<0.01)，4種綠茶中婺源毛尖和浮瑤仙芝與其他3種茶的DPPH自由基清除能力也有顯著差異性(P<0.01)，而有的差異不顯著。

大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖2 不同茶葉清除DPPH自由基能力的比較

Figure 2 Comparison of scavenging DPPH free radical ability of different tea leaves (n=3)

2.2.2 FRAP鐵還原抗氧化能力 將不同種類的茶葉提取液與FRAP試劑反應(yīng)后，反應(yīng)體系變藍(lán)紫色，說明茶葉具有還原Fe3+的能力。茶葉樣品的FRAP值以達(dá)到同樣吸光度所需FeSO4的濃度(mol/L)來表示，F(xiàn)RAP值越大，則鐵還原抗氧化能力越強(qiáng)。如圖4所示，各種茶葉樣品的FRAP值依次為修水寧紅<武夷紅茶<浮紅茶<祁紅茶<狗牯腦<資溪白茶<廬山云霧<浮瑤仙芝<婺源毛尖<靖安白茶<井崗翠綠；3種類型的茶葉鐵還原氧化能力總體呈現(xiàn)出紅茶<白茶和綠茶的趨勢(shì)。3種類型的茶葉鐵還原氧化能力總體呈現(xiàn)出紅茶<白茶和綠茶的趨勢(shì)；不同類型茶葉的鐵還原氧化能力有顯著性差異(P<0.01)；同種類型茶葉中，4種紅茶間的鐵還原氧化能力有顯著性差異(P<0.01)，2種白茶間差異顯著(P<0.01)，5種綠茶中狗牯腦和井崗翠綠與其他3種綠茶的鐵還原氧化能力差異也具顯著性，有的差異不顯著。

大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖3 不同茶葉FRAP值的比較

Figure 3 Comparison of FRAP values of different teas (n=3)

2.2.3 ABTS+自由基清除能力 不同種類的茶葉提取液與ABTS+溶液反應(yīng)后，反應(yīng)體系顏色變淺，說明茶葉提取液具有清除ABTS+自由基的能力。茶葉樣品的抗氧化能力TEAC值以達(dá)到同樣清除率所需Trolox的濃度(mg/L)來表示，TEAC值越大，則對(duì)ABTS+自由基清除能力越強(qiáng)。如圖6所示，各種類型茶葉的ABTS+自由基清除能力依次為浮紅茶<修水寧紅<祁紅茶<武夷紅茶<狗牯腦<廬山云霧<資溪白茶<浮瑤仙芝<靖安白茶<婺源毛尖<井崗翠綠；3種類型茶葉的ABTS+自由基清除能力總體呈紅茶<白茶和綠茶的趨勢(shì)。4種紅茶和2種白茶、5種綠茶相比差異均顯著(P<0.01)，綠茶和白茶相比，其中狗牯腦、廬山云霧、婺源毛尖和井崗翠綠4種綠茶有顯著性差異(P<0.01)，有的差異不顯著；同種類型茶葉的鐵還原氧化能力均有顯著性差異(P<0.01)。

2.2.4 總還原能力 總還原能力既是評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化能力的重要指標(biāo)，又是解釋物質(zhì)抗氧化活性的一種機(jī)理[23]。不同種類的茶葉提取液反應(yīng)10 min后，反應(yīng)體系顏色變深，說明茶葉提取液有還原能力，吸光度越大，則總還原能力越強(qiáng)。如圖7所示，各種類型茶葉的總還原能力依次為修水寧紅<祁紅茶<武夷紅茶<浮紅茶<狗牯腦<資溪白茶<廬山云霧<婺源毛尖<浮瑤仙芝<靖安白茶<井崗翠綠；3種類型茶葉的總還原能力總體呈現(xiàn)出紅茶<白茶和綠茶的趨勢(shì)。4種紅茶和5種綠茶、白茶的總還原能力相比差異顯著(P<0.01)，綠茶和白茶相比大部分有顯著性差異(P<0.01)，僅狗牯腦和資溪白茶差異不顯著；同種類型茶葉的總還原能力均有顯著性差異(P<0.01)。

3 結(jié)論

(1) 本試驗(yàn)建立的5種兒茶素高效液相色譜測(cè)定法標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2都>0.99，精密度試驗(yàn)的RSD在0.11%～2.49%，加標(biāo)回收率在66.24%～123.20%，均符合要求，對(duì)兒茶素測(cè)定結(jié)果比較分析后發(fā)現(xiàn)11種江西名茶中總兒茶素含量大部分差異不顯著，只有靖安白茶跟其他10種茶葉差異極顯著，各種兒茶素含量有較大差異，并且綠茶和白茶總兒茶素及各種兒茶素含量總體比紅茶高。

大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖4 不同茶葉清除ABTS+自由基能力的比較

Figure 4 Comparison of scavenging ABTS free radical ability of different tea leaves (n=3)

大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖5 不同茶葉總還原能力的比較

Figure 5 Comparison of total reduction ability of different tea leaves (n=3)

(2) 本試驗(yàn)測(cè)定了11種江西名茶的DPPH自由基清除能力、鐵還原抗氧化能力、ABTS+自由基清除能力和總還原能力4個(gè)體外抗氧化指標(biāo)并對(duì)其進(jìn)行了比較，結(jié)果表明3種類型茶葉的體外抗氧化能力的總體趨勢(shì)與兒茶素含量的測(cè)定結(jié)果相近，仍為綠茶和白茶>紅茶。可能與各類型茶葉的加工工藝不同有關(guān)。

(3) 綠茶加工過程中的殺青步驟，會(huì)使多酚氧化酶和過氧化酶等酶失活，防止兒茶素等茶多酚的進(jìn)一步破壞，使得綠茶的茶多酚含量基本不變[24]；白茶的加工工藝也比較簡(jiǎn)單，只是微發(fā)酵，其茶多酚含量也沒有很大變化；而紅茶的茶多酚在加工過程中發(fā)生氧化導(dǎo)致其含量有所下降。故從消費(fèi)者喝茶抗氧化、防衰老的角度來說，應(yīng)優(yōu)先選擇井崗翠綠、浮瑤仙芝等綠茶，以及資溪白茶、靖安白茶。