張 怡，高維娟

（河北中醫(yī)學院/河北省中醫(yī)藥防治心腦血管病基礎(chǔ)研究重點實驗室，河北石家莊 050091）

細胞凋亡（apoptosis）和細胞自噬（autophagy）是細胞自我銷毀的兩種主要機制。凋亡，又稱為I型程序性細胞死亡，表現(xiàn)為細胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、DNA降解和片段化，細胞分裂成凋亡小體，隨后被吞噬細胞吞噬、降解[1]。自噬，又稱為II型程序性死亡，是一個高度保守的細胞內(nèi)進化過程。具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體包裹長壽蛋白和受損細胞器，并與溶酶體融合，通過溶酶體途徑移除，在溶解長壽蛋白和受損細胞器的過程中釋放能量，從而為細胞供能[2-3]。大量研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡和細胞自噬之間存在著錯綜復雜的關(guān)系。多種刺激因素，如電離輻射、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、缺氧缺血、化療藥物等均可導致凋亡和自噬的發(fā)生，但由于刺激的程度和刺激時間的不同，凋亡和自噬的強弱也有所差別。如在腦缺血早期階段，細胞自噬被迅速激活，并抑制細胞凋亡的發(fā)生，凋亡和自噬以相互排斥的形式發(fā)展；但隨著缺血時間的延長，自噬被過度激活，導致細胞受損，進而引發(fā)細胞凋亡的發(fā)生，并最終通過凋亡依賴途徑誘導細胞死亡[4]。細胞凋亡和自噬之間可能存在著某種“切換開關(guān)”，確定二者的“切換開關(guān)”對于某些疾病，如腫瘤、腦缺血、神經(jīng)退行性病變的治療及藥物研發(fā)等具有重要意義。Bcl-2是重要的凋亡調(diào)控蛋白，具有抗凋亡的作用，大量研究證實，Bcl-2還可通過結(jié)合Beclin1對細胞自噬起到調(diào)控作用[5]。Beclin1是細胞自噬的關(guān)鍵調(diào)控因子，主要參與自噬體的形成[6]。研究證實，Beclin1與細胞凋亡亦有密切關(guān)系，可通過調(diào)節(jié)Bcl-2的功能調(diào)控細胞凋亡。因此，Bcl-2/Beclin1復合物被認為是細胞凋亡和自噬的“活性開關(guān)”。根據(jù)近年來國內(nèi)外相關(guān)報道，本文對Bcl-2/Beclin1復合物在細胞凋亡和自噬中的調(diào)控作用進行綜述。

1 Bcl-2

Bcl-2（B-cell lymphoma 2）家族對細胞凋亡具有重要的調(diào)控作用。根據(jù)Bcl-2家族的結(jié)構(gòu)和作用，可以將其分為3大類：①含4個結(jié)構(gòu)域BH1-4，并含有1個疏水的BH3（Bcl-2-homology-3）結(jié)合溝的抗凋亡蛋白：Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、CED9等，具有抗凋亡作用；②含有3個結(jié)構(gòu)域BH1-3的促凋亡蛋白Bax、Bak、Bok等，發(fā)揮促凋亡作用；③僅含有BH3的促凋亡蛋白，如Bik、Bid、Bim等[7]，可通過與Bcl-2蛋白結(jié)合，從而釋放促凋亡蛋白，或直接激活促凋亡蛋白，從而促進凋亡的發(fā)生（圖1[10]）。Bcl-2家族被認為是三方凋亡開關(guān)，它通過家族內(nèi)部成員的相互作用實現(xiàn)對細胞凋亡的調(diào)控，抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間的平衡決定細胞的存活或死亡[8]。其中，抗凋亡蛋白Bcl-2因具有拮抗細胞凋亡的功能而被醫(yī)學界廣泛熟知。近年來，抗凋亡蛋白Bcl-2在抑制自噬方面的作用受到越來越多的關(guān)注，它可通過與自噬相關(guān)蛋白Beclin1結(jié)合，抑制細胞自噬的發(fā)生[9]。Bcl-2的這種抗自噬功能對細胞發(fā)揮保護作用，可通過抑制Beclin1突變體誘導的過度自噬維持細胞的存活。

圖1 Bcl-2家族分類及結(jié)構(gòu)圖

2 Beclin1

Beclin1，也稱BECN1基因，是酵母自噬相關(guān)基因Atg6/Vps30的哺乳動物同源基因，位于人類染色體17q21位點，蛋白分子質(zhì)量約為60kD，主要定位于細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）和線粒體內(nèi)。Beclin1是首個被鑒定的介導哺乳動物自噬的基因，是細胞自噬的一個關(guān)鍵調(diào)控因子，它可招募自噬關(guān)鍵蛋白到自噬體前體，與Vps34和ps15形成復合物[11]，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)自噬的活性。Beclin1含有450個氨基酸，形成3個結(jié)構(gòu)域：Bcl-2結(jié)合部位、螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域（coiled-coil domain，CCD）及進化保守結(jié)構(gòu)域（evolutionarily conserved domain，ECD）。此外，Beclin1還含有富含亮氨酸的氨基酸序列，負責有效地核輸出信號（NES）[12]（圖2）。許多自噬調(diào)控蛋白通過與Beclin1不同結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，形成蛋白復合體調(diào)控自噬水平。凋亡抑制因子Bcl-2同樣可以通過BH3結(jié)構(gòu)域與Beclin1結(jié)合，阻止Beclin1依賴的細胞自噬的發(fā)生，導致細胞凋亡。因此，Beclin1通過與自噬相關(guān)蛋白結(jié)合或與凋亡相關(guān)蛋白結(jié)合決定細胞發(fā)生自噬或凋亡[13]。

圖2 Beclin1結(jié)構(gòu)圖

3 Bcl-2/Beclin1復合物對細胞調(diào)亡和自噬的調(diào)控作用

凋亡和自噬在維持細胞自穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，二者之間存在著錯綜復雜的關(guān)系[14]。目前認為，在介導細胞死亡的過程中，凋亡和自噬可能存在以下幾種關(guān)系[13]：①兩種程序同時或者先后啟動，協(xié)同促進細胞的死亡；②自噬抑制凋亡的發(fā)生，自噬通過清除受損細胞器或蛋白，為細胞重新供能，使細胞免于凋亡；③自噬促進凋亡相關(guān)特征的顯現(xiàn)，但并不作為誘發(fā)細胞死亡的直接原因。多種調(diào)控元件（如鞘脂、神經(jīng)酰胺、MAPk、DRP-1等）及信號通路（如PI3K/Akt信號通路）參與了對細胞凋亡和自噬的調(diào)控[15]，而Bcl-2/Beclin1復合物在凋亡和自噬的發(fā)生發(fā)展中起到了“切換開關(guān)”的作用[16]，它決定著細胞是進入凋亡程序還是啟動自噬程序。Beclin1可以通過其BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2蛋白結(jié)合，使Bcl-2與促凋亡蛋白Bax解離，從而激活細胞凋亡；而Beclin1與Bcl-2的結(jié)合同時阻斷了Beclin1對自噬前體的作用，從而抑制了自噬的發(fā)生[17]。

3.1 Beclin1和Bcl-2的表達水平對凋亡和自噬的影響 目前，關(guān)于Beclin1和Bcl-2的表達水平對凋亡和自噬的影響，主要集中在腫瘤的發(fā)生機制和腫瘤耐藥性的研究。研究發(fā)現(xiàn)，在許多腫瘤疾病中Beclin1的表達水平顯著降低，而Bcl-2的表達水平則明顯上調(diào)[18-19]。Beclin1低表達導致自噬清除受損細胞器的能力下降，產(chǎn)生大量活性氧及基因毒性應激，從而導致細胞轉(zhuǎn)化。臨床研究表明，40%～75%的乳腺癌和卵巢癌中存在Beclin1蛋白的丟失，Beclin1蛋白的丟失可能使腫瘤細胞逃避自噬性死亡，從而促進腫瘤細胞的存活[20]。但在直腸癌中，Beclin1卻呈現(xiàn)高表達，采用RNAi技術(shù)抑制直腸癌細胞Beclin1的表達后，可有效抑制直腸癌細胞的自噬及增殖，促進直腸癌細胞凋亡[21]。這些研究結(jié)果表明，Beclin1可通過影響細胞自噬與凋亡，從而影響腫瘤的發(fā)生與預后，但Beclin1調(diào)控腫瘤細胞凋亡和自噬的具體機制尚未明確。Bcl-2不僅具有抗凋亡作用，同時還可通過與Beclin1相互作用，發(fā)揮抑制自噬的作用。在MCF-7細胞中，LIMA等[22]通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)Bcl-2表達誘導的細胞死亡較對照組升高了50%，而其中凋亡僅占該細胞死亡的11%，因此，該研究認為，自噬性細胞死亡可能是造成額外細胞死亡的原因之一。Beclin1的基礎(chǔ)表達可使機體在應對應激刺激做時首先做出自噬反應，從而抑制細胞凋亡的出現(xiàn)；但當Beclin1的表達下調(diào)或缺失時，可導致細胞自噬功能異常，從而誘導細胞凋亡性死亡的發(fā)生[23]。與在MCF-7人乳腺癌細胞系和U87人膠質(zhì)瘤細胞系的研究中得出的結(jié)果相似，在肥厚性瘢痕成纖維細胞的研究中證實，過表達的Bcl-2會抑制Beclin1表達的升高及自噬體的形成，而下調(diào)Bcl-2的表達則有助于Beclin1的激活和自噬的發(fā)生[24]。在HEPG2肝癌細胞系中，采用ABT737抑制Bcl-2的表達導致促凋亡相關(guān)基因及自噬相關(guān)基因（如Beclin1、LC3等）表達升高，誘導細胞自噬的激活以及細胞的死亡[25]。

3.2 Bcl-2/Beclin1復合物的細胞定位及其所結(jié)合的因子對凋亡和自噬的影響 Bcl-2/Beclin1的相互作用對凋亡和自噬的影響，除了受Bcl-2和Beclin1表達水平的影響外，同時還受細胞定位的影響。研究表明，Bcl-2和Beclin1的相互作用存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之中[26]，但只有定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Beclin1和Bcl-2相互作用對自噬具有調(diào)節(jié)作用，而定位于線粒體的Bcl-2則主要發(fā)揮對細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，無調(diào)控自噬的功能[27]。

除受細胞定位的影響外，與Bcl-2和Beclin1相結(jié)合的因子對Bcl-2/Beclin1的切換開關(guān)作用也有重要影響。Beclin1和Bcl-2可與其它的自噬調(diào)節(jié)蛋白在不同的細胞位置形成復合物，從而影響凋亡和自噬的進程。研究證實，自噬相關(guān)蛋白AMBRA1（activating molecule in Beclin1-regulated autophagy）作為一個自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與Beclin1和Bcl-2均能相互作用。當受到自噬刺激時，磷酸化自噬相關(guān)基因Ulk1（unc-51 like kinase 1）磷酸化AMBRA1，從而使AMBRA1從動力蛋白復合體（dynein motor complex）中分離，分離后的AMBRA1易位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與自噬啟動復合體中的Beclin1結(jié)合，從而導致細胞自噬的發(fā)生[28]。高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）是一種Beclin1結(jié)合蛋白，對維持自噬起著重要作用，它能夠和Bcl-2競爭與Beclin1的相互作用，并將Beclin1定位于自噬體。Bcl-2/E1B-19kDa相互作用蛋白3（BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3，BNIP3），是另一種通過與Bcl-2結(jié)合，從而抑制Bcl-2與Beclin1形成復合物的蛋白質(zhì)，它通過其BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2結(jié)合，從而使Bcl-2/Beclin1解離，激活細胞自噬[29]。

3.3 Bcl-2/Beclin1通過Ser/Thr蛋白激酶調(diào)控凋亡和自噬 除受細胞定位和結(jié)合因子的影響外，Ser/Thr激酶，包括死亡相關(guān)蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）、JUN N-末端激酶1（c-Jun N-terminal protein kinase 1，JNK1）和AKT（也稱為PKB），均參與了對Bcl-2/Beclin1復合物的調(diào)控[30]。DAPK在BH3結(jié)構(gòu)域（Thr119）對Beclin1進行磷酸化，從而誘導Bcl-2/Beclin1復合物的解離，最終促進自噬的發(fā)生；還有研究還發(fā)現(xiàn)，DAPK能夠通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的表達水平，從而誘導內(nèi)皮細胞凋亡的發(fā)生[31]。凋亡和自噬進程還受JNK1介導的Bcl-2磷酸化的調(diào)節(jié)[32]。WEI等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)缺乏的情況下，JNK1蛋白被激活，并導致Bcl-2位于BH4和BH3結(jié)構(gòu)域之間的包括Thr69、Ser70、Ser87在內(nèi)的多個殘基磷酸化。但根據(jù)營養(yǎng)缺乏持續(xù)時間的不同，JNK1介導的Bcl-2磷酸化對凋亡和自噬的影響也不同。JNK1介導的Bcl-2的快速磷酸化可以通過解離Bcl-2/Beclin1復合物激活自噬，從而促進細胞存活；但當營養(yǎng)缺乏16h后，JNK1介導的Bcl-2磷酸化就轉(zhuǎn)變?yōu)榻怆xBcl-2/Bax復合物，從而激活Caspase-3凋亡信號通路，促進細胞凋亡的發(fā)生[34]。另有研究表明，促凋亡蛋白激酶Mst1能夠通過磷酸化Beclin1協(xié)調(diào)自噬和凋亡的關(guān)系，同時調(diào)節(jié)Bcl-2、Beclin1和Bax三者間的相互作用[35]。

4 小結(jié)

細胞凋亡和自噬作為機體的兩種進化保守機制，在維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)、機體發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著核心作用，二者之間關(guān)系密切。受所受到的刺激因素及所處疾病階段的影響，凋亡與自噬相互排斥，又協(xié)同發(fā)生、同步增強。細胞凋亡和自噬之間存在錯綜復雜的關(guān)系，Bcl-2/Beclin1復合物在二者的切換中起著至關(guān)重要的作用。Bcl-2/Beclin1復合物可以作為“變阻器”發(fā)揮對凋亡和自噬的調(diào)節(jié)作用，確保凋亡及自噬水平均保持在穩(wěn)態(tài)范圍內(nèi)，其對凋亡和自噬的調(diào)控作用受Bcl-2和Beclin1的表達水平、細胞定位、所結(jié)合的因子及Ser/Thr蛋白激酶等多種因素的調(diào)控。但是，凋亡和自噬的相互關(guān)系十分復雜，不僅受Bcl-2/Beclin1復合物的調(diào)節(jié)，還受到一些其它信號通路和信號因子的調(diào)控。因此，對于凋亡和自噬的關(guān)系仍需要進一步深入探討，明確凋亡和自噬間的相互作用，無論是對正常的生長發(fā)育過程或是疾病的發(fā)生及進展過程都具有重要的意義。