盛青 鄒威鳳 周強(qiáng) 周曉婷 黎希

廣州市胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科（廣州510095）

【關(guān)鍵字】 p38 絲裂原活化蛋白激酶；結(jié)核分枝桿菌；結(jié)核??；菌落形成單位；骨髓來源的巨噬細(xì)胞

固有免疫反應(yīng)除了作為保護(hù)宿主免受病原體感染的第一道防線，在抗病原菌感染中發(fā)揮重要作用之外，還可通過產(chǎn)生各種特異性細(xì)胞因子和趨化因子來激活宿主的適應(yīng)性免疫反應(yīng)［1］。其中巨噬細(xì)胞可利用其細(xì)胞表面或胞內(nèi)的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRRs）識別病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號分子，如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），其中包括p38 MAPK、胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和c-Jun 氨基末端激酶等信號分子，這些信號分子可促進(jìn)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，并進(jìn)一步促進(jìn)機(jī)體的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而在抗病原菌感染中發(fā)揮重要作用。雖然許多干預(yù)措施側(cè)重于調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，但固有免疫反應(yīng)對于宿主保護(hù)也是至關(guān)重要的［2］。研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)核菌感染巨噬細(xì)胞過程中，p38 MAPK 信號通路可促進(jìn)感染細(xì)胞內(nèi)吞噬體的成熟［3］和細(xì)胞凋亡進(jìn)程［4］，另外也介導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-6 的表達(dá)［1］，這些發(fā)現(xiàn)提示巨噬細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK 信號通路在抗結(jié)核菌感染過程中具有重要作用，然而，p38 MAPK信號通路是否能夠抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌的存活尚不可知。因此，本文將研究巨噬細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK 信號通路在抗結(jié)核菌感染中的具體作用和分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF 級8～10 周齡雄性C57BL/6 小鼠10 只，體質(zhì)量（18 ± 0.5）g，由深圳第三人民醫(yī)院肝病研究所提供。

1.1.2 主要儀器和試劑 ACK LYSING BUFFER（Invitrogen），重組小鼠M-CSF（peprotech），DMEM培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Gibco），結(jié)核菌H37Ra（上海楚瑞生物有限公司），Phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）（28B10）Human mAb（APC）（eBioscience），Phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）（D3F9）XP?Rabbit mAb（CST），Lyse/Fix Buffer（5x）（BD），Perm Buffer Ⅲ（BD），實(shí)時(shí)定量PCR 儀（Roche），紫外分光光度儀（DeNovix），普通PCR儀（ABI），高速離心機(jī)（Eppendorf），流式細(xì)胞儀（BD FACSCantoⅡ）。

1.2 方法

1.2.1 肺結(jié)核小鼠的構(gòu)建 隨機(jī)將8～10 周齡雄性C57BL/6 小鼠分成兩組，每組各5 只，分別通過氣溶膠霧化吸入大約150 CFUs H37Ra 和等體積的PBS 液體［5］，1 個(gè)月后處死小鼠，取其肺臟，分離肺組織淋巴細(xì)胞。

1.2.2 p38 MAPK的磷酸化檢測 20倍體積的預(yù)熱1x Lyse/Fix Buffe 立即固定細(xì)胞，37 ℃孵育10 min，5 000 r/min離心5 min，去上清；振蕩片刻，加入1 mL預(yù)冷Perm BufferⅢ，冰上破膜30 min；FACS buffer洗兩次，染色（p-p38 APC 1∶100），常溫孵育30 min；FACS buffer 洗兩次，并在流式細(xì)胞儀上檢測p38 MAPK 的磷酸化水平。

1.2.3 分離與培養(yǎng)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞 從小鼠脛骨和股骨中分離骨髓細(xì)胞，單細(xì)胞懸于DMEM 培養(yǎng)基中，其中DMEM 培養(yǎng)基中加有10%FBS 和20 ng/mL M-CSF，放置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，收集巨噬細(xì)胞。

1.2.4 蛋白印跡檢測 提取細(xì)胞蛋白后，將蛋白定量后平均加入12%聚丙烯酰胺凝膠中，蛋白被分離后轉(zhuǎn)入硝酸纖維素膜中，隨后用特異性一抗p-p38 MAPK 孵育過夜，次日孵育二抗，加入適當(dāng)發(fā)光液曝光檢測。

1.2.5 qRT-PCR 檢測 根據(jù)Total RNA Kit I 說明書抽提總RNA；RNA 濃度和A260/280 比率由紫外分光光度儀檢測；通過PrimeScript?RT kit 反轉(zhuǎn)錄成cDNA；qPCR 由SYBR Green PCR Master Mix 按照標(biāo)準(zhǔn)步驟操作；所有基因的mRNA 與管家基因GAPDH 以2-ΔΔCT函數(shù)值進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 CFU 計(jì)數(shù) 結(jié)核菌H37Ra 以MOI=5 感染巨噬細(xì)胞，分別孵育4 h 與72 h 后，用無菌PBS 清洗2 遍，隨后用0.1%SDS 裂解細(xì)胞，裂解物被依次稀釋成3 個(gè)梯度，分別接種于7H11 Middlebrook 瓊脂培養(yǎng)板上，在5% CO2和37 ℃的條件下培養(yǎng)，3～4 周后計(jì)數(shù)各平板菌落數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以H37Ra 霧化小鼠的結(jié)核組和PBS 的對照組肺組織p38 MAPK 的磷酸化水平、不同組間細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌吞噬率和存活率以及不同組間細(xì)胞IL-6、TNF-α及IL-1β mRNA的相對水平為計(jì)數(shù)資料，以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同小鼠肺組織中p38 MAPK磷酸化水平的比較 如圖1所示，H37Ra霧化組肺組織中p38 MAPK的磷酸化水平（2.115 ± 0.2960）%顯著高于PBS 霧化組（0.4250 ± 0.1075）%，兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.493，P=0.000 6）。

圖1 PBS 和H37Ra 霧化的小鼠肺組織中p38 MAPK 的磷酸化水平Fig.1 Phosphorylation level of p38 MAPK in lung homogenate of mice atomized with PBS and H37Ra

2.2 H37Ra 感染小鼠巨噬細(xì)胞前后p38 MAPK 磷酸化水平的比較 接著檢測巨噬細(xì)胞中p38 MAPK信號通路與結(jié)核菌感染的關(guān)系，如圖2所示，與空白對照相比，結(jié)核菌H37Ra 感染巨噬細(xì)胞15、30、45 以及60 min 后，其胞內(nèi)p38 MAPK 的磷酸化水平逐漸增加。

圖2 蛋白印跡法檢測H37Ra 在不同時(shí)間點(diǎn)感染巨噬細(xì)胞后p38 MAPK 的磷酸化水平Fig.2 Western Blot analysis of phosphorylation level of p38 MAPK after H37Ra infection of macrophages at indicated time points

2.3 p38 MAPK 信號通路對巨噬細(xì)胞控制結(jié)核菌感染的影響 為了進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞中p38 MAPK 信號通路在結(jié)核菌感染中的作用，筆者利用SB203580 抑制細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK 活性后，檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌吞噬率和存活率的變化。如圖3A 所示，空白對照組細(xì)胞內(nèi)H37Ra 吞噬率為（80.00 ± 5.774）%，SB203580 抑制組細(xì)胞內(nèi)H37Ra吞噬率為（75.00 ± 2.887）%，兩者間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.774 6，P=0.481 8）；如圖3B所示，空白對照組細(xì)胞內(nèi)H37Ra 存活率為（100.0 ± 5.774）%，SB203580 抑制組細(xì)胞內(nèi)H37Ra 存活率為（130.0 ±5.774）%，SB203580 抑制組細(xì)胞內(nèi)H37Ra 存活率顯著高于空白對照組，兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.674，P=0.021 3）。

圖3 p38 MAPK 信號通路對巨噬細(xì)胞吞噬H37Ra 和殺菌活性的影響Fig.3 Effect of p38 MAPK signaling pathway on uptake of H37Ra and bactericidal activity of macrophages

2.4 p38 MAPK 信號通路對結(jié)核菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的影響 由于巨噬細(xì)胞主要通過炎癥因子發(fā)揮抗感染作用，因此筆者檢測p38 MAPK 信號通路對結(jié)核菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)有影響，結(jié)果如圖4A所示，H37Ra+SB203580感染組IL-6 mRNA 表達(dá)水平（70.005.774）顯著低于H37Ra 感染組（150.0 ± 5.774），兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.789，P=0.000 6）；如圖4B 所示，H37Ra+SB203580 感染組TNF-α mRNA 表達(dá)水平（7.667 ± 0.881 9）顯著低于H37Ra 感染組（16.00±1.155），兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.735，P=0.004 6）；如圖4C 所示，H37Ra+SB203580 感染組IL-1β mRNA 表達(dá)水平（8.000 ± 0.577 4）顯著低于H37Ra 感染組（25.00 ± 1.732），兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.311，P=0.000 7）。

圖4 p38 MAPK 信號通路對H37Ra 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的影響Fig.4 Effect of p38 MAPK signaling pathway on H37Ra-induced cytokine expression in macrophages

3 討論

研究宿主對結(jié)核菌感染的抗性或易感性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制或信號分子對于開發(fā)新的結(jié)核病控制策略非常重要［6］。尤其對常規(guī)抗結(jié)核治療具有耐受性的耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核菌株更為重要。最近，已經(jīng)鑒定出幾種宿主分子可作為潛在的宿主定向治療（host-direct therapy，HDT）靶點(diǎn)［7］。在這項(xiàng)研究中，筆者首次發(fā)現(xiàn)p38 MAPK 可以抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌的存活，提示p38 MAPK 可能是HDT抗結(jié)核病的新靶點(diǎn)。在肺結(jié)核小鼠模型中筆者發(fā)現(xiàn)，肺組織中p38 MAPK 的磷酸化活性顯著增加，表明p38 MAPK 信號通路參與了小鼠肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展過程，但具體發(fā)揮怎樣的作用仍未清楚。

結(jié)核菌主要通過呼吸道感染宿主，起初被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬，在巨噬細(xì)胞表面含有大量的PRRs，可識別結(jié)核菌中的PAMPs，如脂多糖等，激活細(xì)胞內(nèi)一系列重要的信號通路，參與各種細(xì)胞反應(yīng)［8］，并激活T 細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答［9］。其中p38 MAPK 信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的活化通路之一［8］。在結(jié)核菌感染巨噬細(xì)胞過程中，p38 MAPK信號通路可促進(jìn)感染細(xì)胞內(nèi)吞噬體的成熟［3］和細(xì)胞凋亡進(jìn)程［4］。且有研究［10］發(fā)現(xiàn)，劇毒結(jié)核菌株可通過去磷酸化作用抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK 的磷酸化活性，而減毒結(jié)核菌株誘導(dǎo)的p38 MAPK 磷酸化活性明顯更高，這些發(fā)現(xiàn)與筆者的結(jié)果一致，但p38 MAPK 信號通路是否能抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌的存活有待進(jìn)一步論證。接著筆者發(fā)現(xiàn)在結(jié)核菌感染巨噬細(xì)胞的過程中，p38 MAPK信號活性逐漸增加，同時(shí)抑制其活性后，巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌的存活率增加，表明p38 MAPK 信號通路確實(shí)能夠抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌的存活。

上述發(fā)現(xiàn)表明p38 MAPK 信號通路的激活可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗結(jié)核菌感染的作用，因此，筆者初步分析p38 MAPK 信號通路增強(qiáng)巨噬細(xì)胞內(nèi)抗結(jié)核菌感染的分子機(jī)制。筆者發(fā)現(xiàn)在結(jié)核菌感染巨噬細(xì)胞過程中，抑制p38 MAPK 活性后，巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著下降，包括IL-6、TNF-α及IL-1β等，表明p38 MAPK 信號通路可能通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)水平參與抗結(jié)核菌感染的過程，而TNF-α在結(jié)核病的早期和長期控制中起著至關(guān)重要的作用［11］，如巨噬細(xì)胞在識別結(jié)核菌細(xì)胞壁PAMPs后分泌TNF-α，隨后激活巨噬細(xì)胞，將其遷移到感染部位，參與肉芽腫的形成［12］。另外，TNF-α可上調(diào)一氧化氮合酶2 的表達(dá)，并進(jìn)一步誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氮中間體的產(chǎn)生，介導(dǎo)胞內(nèi)殺滅結(jié)核菌的過程［13］。另外有研究發(fā)現(xiàn)由于IL-6 缺陷型小鼠在結(jié)核菌感染后病理反應(yīng)加重，提示筆者IL-6 在保護(hù)宿主免受結(jié)核菌感染中也起著至關(guān)重要的作用［13］。因此，筆者初步認(rèn)為，在結(jié)核菌感染巨噬細(xì)胞過程中，p38 MAPK 信號通路可能通過調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá)水平參與各種宿主防御反應(yīng)，如細(xì)胞自噬、凋亡或應(yīng)激等。總之，宿主細(xì)胞中p38 MAPK 的活性與抗結(jié)核菌感染過程密切相關(guān)，對清除巨噬細(xì)胞中結(jié)核菌具有重要的作用，這一成果為p38 MAPK 潛在的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，可能作為HDT 抗結(jié)核病治療的新靶點(diǎn)。