馮濤 何紀元 薛原

摘要 為分析雞源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制，使用PCR技術從對喹諾酮類藥物具有耐藥性的大腸桿菌中擴增出喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）基因。通過對所測序列結(jié)果的分析，得到DNA促旋酶和拓撲異構酶Ⅳ基因（gyrA、gyrB、parC、parE）的突變位點及其氨基酸的表達情況。根據(jù)基因型研究QRDR的流行病學情況，可指導喹諾酮類藥物的臨床合理用藥。

關鍵詞 大腸桿菌;gyrA基因;gyrB基因;parC基因;parE基因

中圖分類號 S852.61文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）11-0106-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.029

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract In order to analyze the drugs resistance mechanism of fluoroquinolone to Escherichia coli from chicken，PCR technology was used to amplify determining area （QRDR）? gene in E.coli with drugs resistance of E.coli. According to sequencing results of obtained sequences， the mutation sites and amino acid expression of DNA gyrase and topoisomerase Ⅳ genes （gyrA，gyrB，parC，parE） were determined.? The study on the? epidemic situation of QRDR according to the genotype could guide the rational drug use in the clinic .

Key words Escherichia coli;gyrA gene;gyrB gene;parC gene;parE gene

基金項目 國家自然科學基金項目（31502119）;黑龍江省博士后科研啟動金資助項目（LBH-Q14002）。

作者簡介 馮濤（1996—），女，河北承德人，碩士研究生，研究方向：細菌耐藥性研究。*通信作者，副教授，博士，碩士生導師，從事細菌耐藥性研究。

收稿日期 2018-12-24

喹諾酮類藥物在獸醫(yī)臨床上的應用有近 30 年的歷史，是一類作用強、抗菌譜廣的化學合成抗菌藥[1]。但這類藥物的使用頻率日益深化，大腸桿菌對這類藥物的影響程度越來越高[2]。被gyrA和gyrB 基因編碼的DNA 促旋酶和被parC 和parE基因編碼的拓撲異構酶Ⅳ是喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥機制的主要作用區(qū)域[3]。在大腸桿菌中，gyrA 基因所表達的第67～106位氨基酸在報道中經(jīng)常有突變的情況產(chǎn)生，而這種突變會導致大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥或者使該菌株敏感性降低，即為喹諾酮的耐藥決定區(qū)[4]。

筆者采用聚合酶鏈式反應（PCR）分離的大腸桿菌進行了喹諾酮類耐藥基因突變的檢測，了解東北地區(qū)雞源大腸桿菌對喹諾酮類抗生素的耐藥情況，以期為指導該類抗菌藥物的臨床合理應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，試驗菌株為采自東北三省不同地區(qū)的多個雞源養(yǎng)殖場413株大腸桿菌。

1.1.2 主要儀器和試劑。DNA 片段凝膠回收和質(zhì)粒小量提取試劑盒（愛思進生物技術有限責任公司）;DL2000 DNA Marker和Taq酶購自大連寶生物工程有限公司;DYY-6型電泳儀（北京市六一儀器廠）;凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Alpha Imager2200公司）;YEAR2000 PCR儀（德國Biometra公司）。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增。參考文獻[5-7]得到相應的引物序列，將序列送至哈爾濱博士生物有限公司合成QRDR基因的引物序列，利用合成的引物序列對413株大腸桿菌樣本進行PCR擴增，并對所擴增得到的PCR產(chǎn)物進行電泳驗證。

1.2.2 目的片段測序分析。以QRDR基因4種不同引物擴增所得的PCR產(chǎn)物擴增樣本用膠回收純化后與18-T載體連接，并轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細胞E.coli DH5α中克隆復制，將質(zhì)粒樣本送至哈爾濱博仕生物技術有限公司測序部進行序列測定。將返回的核苷酸序列利用DNAStar軟件分析，與GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列比對，得出其序列的突變位點和特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 gyrA、gyrB、parC、parE基因的檢測結(jié)果

在413株雞源大腸桿菌中，gyrA基因被檢出呈陽性的有107株，陽性率為25.91%;gyrB基因的陽性菌株有219株，檢出率為5303%;parC基因被檢出呈陽性的菌株有201株，parE基因被檢出呈陽性的菌株有263株，陽性率分別為48.67% 和6368%（圖1～4）。

2.2 gyrA、gyrB、parC、parE基因的氨基酸序列分析結(jié)果

菌株的gyrA基因存在堿基發(fā)生突變的現(xiàn)象，導致gyrA基因所表達的氨基酸發(fā)生取代現(xiàn)象。主要包括

Leu55→Pro、Ser83→Leu、Asp87→Gly、Phe109→Leu和Ala136→Val，其中18K、26K、d31 3株有雙位點氨基酸取代的情況出現(xiàn)。15個菌株中有7個菌株都發(fā)生Ser83→Leu突變，d31菌株表達為83位和87位的熱點突變同時出現(xiàn)。菌株f14和f53 gyrB基因的堿基有突變發(fā)生，主要表現(xiàn)為Pro404→Ser、Leu451→Pro和Cys410→Tyr。耐藥菌株S44、S49、S67、S82、22K、29K的parC基因堿基發(fā)生突變?nèi)鏢er58→Ile、Gln62→Lys、Val122→Ala、Thr147→Ala和Val284→Met，這些氨基酸的改變也會使大腸桿菌降低其對藥物的敏感性。 菌株16R發(fā)生Gln363→Arg突變，導致parE亞基發(fā)生氨基酸取代。

3 討論

近年來，人類和動物分離的大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥的菌株迅速增多[2]。構成DNA促旋酶和拓撲異構酶Ⅳ的氨基酸發(fā)生突變，影響了這2種酶的表達，導致大腸桿菌對喹諾酮類藥物的結(jié)合能力發(fā)生了變化，從而導致耐藥性的產(chǎn)生[3]。國內(nèi)外研究表明，喹諾酮類藥物的高水平耐藥已經(jīng)成為一個日益嚴重的問題[3]。該研究結(jié)果表明，多個基因突變位點在菌株中同時存在，高水平耐藥也是由于多個位點的同時突變所產(chǎn)生的，這與劉曉強[8]的研究結(jié)果相似。該試驗對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，并且對測序結(jié)果進行比對分析，得到部分基因突變，從而使其表達的氨基酸發(fā)生突變。該試驗對4種喹諾酮類藥物進行耐藥性研究，發(fā)現(xiàn)雞源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性均偏高，說明這些突變的產(chǎn)生提高了細菌的耐藥水平。

該研究中雞源大腸桿菌的gyrA基因檢測出Ser83→Leu、Asp87→Gly;gyrB基因發(fā)生Pro404→Ser、Cys410→Tyr、Leu451→Pro突變;parC基因發(fā)生Ser58→Ile、Gln62→Lys、Val122→Ala、Thr147→Ala和Val284→Met突變;parE基因發(fā)生Gln363→Arg突變。據(jù)報道[1-7]，gyrA基因表達的氨基酸易發(fā)生突變的最普遍位點為第81～87位，表現(xiàn)為發(fā)生一個或者幾個氨基酸被另一種取代，而大腸桿菌對喹諾酮類藥物表現(xiàn)出高度耐藥，其主要原因就有第83位的絲氨酸經(jīng)常被亮氨酸所取代。gyrB基因編碼的氨基酸的突變則主要表現(xiàn)在第 426 和第 447 位上，其中第426位突變?？沙尸F(xiàn)為大腸桿菌對喹諾酮類藥物均可以有耐藥情況產(chǎn)生，而第447位突變表現(xiàn)為對萘啶酸的耐藥性較為增強[1]。在近幾年分離的大腸桿菌耐藥菌株中，gyrA基因熱點突變的概率會比gyrB基因突變的概率大得多[9]。目前研究表明，parC和parE基因發(fā)生不同位點的突變，會使細菌的耐藥水平顯著提高。但是，只有當表達促旋酶的基因發(fā)生的位點突變會產(chǎn)生對喹諾酮類藥物耐藥時，才會有parC和parE的位點突變產(chǎn)生。以上突變結(jié)果中，gyrA的熱點突變Ser83→Leu和Asp87→Gly與任艷娜等[1]的研究結(jié)果相一致。

另外，非特異性耐藥機制在較復雜的多重耐藥中同樣具有十分重要的作用，不僅對喹諾酮類藥物的耐藥有影響，而且對其他不同種類的抗生素均會產(chǎn)生耐藥的情況，但這種耐藥機制是否會對大腸桿菌和喹諾酮類藥物的耐藥水平有影響還需要進一步研究。喹諾酮藥物是一種經(jīng)過人工設計合成的化學抗生素，若要防止其耐藥性的傳播范圍和頻率以及耐藥水平的不斷增強，可以優(yōu)先考慮人為改變其藥物結(jié)構，從而減少DNA 促旋酶和拓撲異構酶Ⅳ的基因突變對耐藥性的影響。

參考文獻

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