唐桃霞，王致和，張秀華，周彥芳，謝忠清

（甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院，甘肅武威733006）

0 引言

甜葉菊（Stevia rebaudiana(Bertoni)Hemsl.）是菊科甜葉菊屬多年生草本植物，又名甜草、甜菊，原產(chǎn)于巴拉圭、巴西等國家[1]。甜葉菊含有14種微量元素，32種營養(yǎng)成分，具有豐富的營養(yǎng)價值，其最為重要的次生代謝產(chǎn)物——甜菊糖苷（Steviol glycosides），是作為甜葉菊主要提取物的新型天然甜味劑[2-3]，其中蛇菊苷（Stevioside，STV）和萊鮑迪苷A（Rebaudioside A，RA）為含量最高的兩個組分，RA的含量僅次于STV，甜度極高，約為蔗糖的300倍，其甜味最接近蔗糖，比STV的甜味更為甘醇，澀味少[4]，市場前景廣闊[5]。有效評價甜葉菊種質(zhì)是選育高產(chǎn)、高RA含量甜葉菊品種的前提條件。影響甜葉菊品種優(yōu)劣的因素眾多，如果僅憑單個性狀來評價而忽略其它因素，在一定程度上割裂了各性狀對品質(zhì)的綜合影響，則有失全面性[6]，而灰色關(guān)聯(lián)度評價能夠綜合考慮諸多因素，對品種的評價更加客觀、合理[7]，在其他作物上已有應(yīng)用[8-10]，而在甜葉菊種質(zhì)資源綜合評價方面目前還存在空白。因此，本文以7份甜葉菊材料為研究對象，利用灰色關(guān)聯(lián)度分析法對其產(chǎn)量和品質(zhì)等性狀進(jìn)行綜合評價，旨在客觀、全面地評價甜葉菊種質(zhì)，為甜葉菊新品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試7份甜葉菊種質(zhì)材料是從國內(nèi)各地引進(jìn)的甜葉菊優(yōu)良品種的母根扦插苗，分別為GT-1、GY-23、GY-24、GY-25、GY-26、GY-27、GY-28，將以上7份材料用代號 X1、X2、…、X7表示。

1.2 試驗設(shè)計

試驗地位于甘肅省武威市涼州區(qū)黃羊鎮(zhèn)甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院試驗基地（103°05′E，37°30′N），海拔1 740 m，屬大陸性干旱氣候，年平均氣溫7.7℃，年平均降雨量194.75 mm，年均日照時數(shù)2 724.8 h，無霜期150 d左右。供試土壤為砂壤土，肥力均勻。將從各地引入的不同品種的母根移栽至溫室，于2018年3月30日剪取插穗扦插，扦插苗長至2018年5月16日，移栽至鋪有黑色地膜的試驗小區(qū)，試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，小區(qū)面積60 m2，每膜4行，重復(fù)3次，株距約0.2 m，行距約0.4 m，保苗約12 000株/hm2。于9月6日取樣測產(chǎn)。

1.3 測定項目及方法

采收期對小區(qū)中間行植株進(jìn)行產(chǎn)量測定及農(nóng)藝性狀考察，考察的農(nóng)藝性狀包括株高（K1）、主莖粗（K2）、一級分枝數(shù)（K3）、葉長（K4）、葉寬（K5）、葉厚（K6）、單株鮮葉重（K7）、單株干葉重（K8）、葉莖比（K9）；考察干葉公頃產(chǎn)量（K10）；考察的品質(zhì)性狀包括RA含量（K11）、RA/總苷（%）（K12），RA公頃產(chǎn)量（K13），共13個指標(biāo)，具體方法如下：

株高：測定時取中間行20株，每株用卷尺自地面量至生長點；主莖粗：用游標(biāo)卡尺測定莖基部1 cm處的粗度；葉長：從生長點向下數(shù)第5對葉子，從葉尖量至葉基處；葉寬：量取葉子中間最寬處；葉厚采用游標(biāo)卡尺測量，測定葉子中間厚度（不包括主葉脈）；將莖葉分離后，測定單株鮮葉重；自然陰干后，65℃烘箱烘至恒重，稱量各材料的單株干葉重，單株干莖重，計算葉莖比，然后將干葉粉細(xì)后，裝入樣品袋待測糖苷。

采用Waters 2695高效液相色譜儀測定糖苷含量，優(yōu)GB 8270-2014標(biāo)準(zhǔn)，流動相為乙腈和磷酸緩沖液，體積比為32∶68，色譜柱為蘭州化物所的ATC18反相色譜柱，填料：Sino ODSAP，柱長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5μm，流速為1 mL/min，紫外檢測波長為210 nm，根據(jù)出峰面積計算出RA含量及總苷含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Execl 2003和SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，利用方差分析和多重比較對各指標(biāo)進(jìn)行顯著性分析，并進(jìn)一步運用灰色關(guān)聯(lián)度[11]進(jìn)行分析，具體如下。

1.4.1 確定參考序列X0及無量綱化處理

運用灰色系統(tǒng)理論，把所有供試的7份種質(zhì)資源作為一個灰色系統(tǒng)。各品種為系統(tǒng)中的一個因素。把品種選育目標(biāo)與優(yōu)良品種的上限結(jié)合起來，構(gòu)建一個理想品種，以理想品種的各性狀指標(biāo)構(gòu)成參考數(shù)列，記為X0，試驗品種的各性狀值為比較數(shù)列，記為Xi（k）（i=1，2，3，…，m；k=1，2，3，…，n），其中m為參試品種數(shù)，本研究中m為7，n為性狀數(shù)量，本研究中n為13。

采用初值化方法，即Xi數(shù)值分別除以X0，將原始數(shù)據(jù)無量綱化處理。

1.4.2 計算灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)

關(guān)聯(lián)系數(shù)公式如下：

1.4.3 計算灰色關(guān)聯(lián)度

等全關(guān)聯(lián)度公式（2）、權(quán)重系數(shù)公式（3）、加權(quán)關(guān)聯(lián)度公式（4）。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試甜葉菊種質(zhì)材料各指標(biāo)分析

由表1可知，7個甜葉菊品種的農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量表現(xiàn)不同。通過顯著性分析可知，各組間株高差異不顯著，且株高變化范圍在65.00～80.33 cm；主莖最粗的為GY-27（X6），最細(xì)的為GY-24（X3），兩者差異顯著；一級分枝數(shù)最多的為GY-25（X4），為28.67個；葉長變化范圍在5.20～7.33 cm之間；葉厚變化范圍在0.43～0.87 mm之間；單株鮮葉產(chǎn)量和單株干葉產(chǎn)量最高的均為GY-23（X2），分別達(dá)240.70 g/株和66.54 g/株；葉莖比的平均值為1.00～1.44，干葉公頃產(chǎn)量最高的為GY-23（X2），可達(dá)7 984.8 kg/hm2，顯著高于GY-27（X6）的4 488.0 kg/hm2。

甜葉菊干葉中糖苷分析結(jié)果如圖1所示，GY-27（X6）的RA含量明顯低于其余各品種，其余6個品種間RA含量不顯著；RA/總苷比值最高的為GY-26（X5），最低的為GY-27（X6）；RA公頃產(chǎn)量最高的為GY-23（X2），最低的為GY-27（X6），兩者之間差異顯著。

表1 7個甜葉菊品種的農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量Table1 Theagronomic character s and yield of 7 stevia varieties

圖1 7個甜葉菊品種的RA含量Fig. 1 The RA content of 7 stevia varieties

2.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析

2.2.1 構(gòu)建參考序列

本研究以選擇出高產(chǎn)、高RA含量的甜葉菊品種為研究目標(biāo)，參考數(shù)列X0的株高、主莖粗、一級分枝數(shù)、葉長、葉寬、葉厚、單株鮮葉產(chǎn)量、單株干葉產(chǎn)量、葉莖比、干葉產(chǎn)量、RA含量、RA/總苷及RA公頃產(chǎn)量，選用7份材料中最大測定值，構(gòu)成最優(yōu)指標(biāo)集

2.2.2 無量綱化處理，并求絕對差值

各指標(biāo)測定值的計量單位和量綱不同，不能直接進(jìn)行比較，因此需要對各營養(yǎng)成分的初始數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化標(biāo)準(zhǔn)處理（表2），使數(shù)值壓縮在[0，1]區(qū)間內(nèi)，從而具有同等性和可比性[11]。

原始數(shù)據(jù)無量綱化后，求得7個材料Xi與參考數(shù)列X0的絕對差值（表3），其中二級最小差值為0，二級最大差值為0.8179。

表2 數(shù)據(jù)的無量綱化處理Table 2 Standard transformed data

2.2.3 求關(guān)聯(lián)系數(shù)

7份甜葉菊種質(zhì)材料與參考序列之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)根據(jù)公式（1）計算可得，結(jié)果如表4所示。

表3 X0與Xi的絕對差值Table3 Absolutedifferences between X0 and Xi

表4 7個甜葉菊品種與參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)Table4 Correlation coefficients of 7 stevia varieties and reference number series

2.2.4 計算關(guān)聯(lián)度

由灰色關(guān)聯(lián)度理論中的關(guān)聯(lián)度分析原則[12]可知，參考序列的產(chǎn)量和品質(zhì)最佳，甜葉菊各品種與參考序列的關(guān)聯(lián)度越大，其綜合性狀就越好。根據(jù)等權(quán)關(guān)聯(lián)度的公式（2）計算得出等權(quán)排序，等權(quán)關(guān)聯(lián)度由大到小依次是GY-23（X2）＞GY-26（X5）＞GT-1（X1）＞GY-25（X4）＞GY-27（X6）＞GY-28（X7）＞GY-24（X3），等權(quán)關(guān)聯(lián)度反映的是各測定性狀對綜合表現(xiàn)具有同等貢獻(xiàn)[13]，而在甜葉菊品種綜合表現(xiàn)中，每個性狀指標(biāo)對綜合表現(xiàn)的貢獻(xiàn)不同，因此采用加權(quán)關(guān)聯(lián)度進(jìn)行再次評價，利用權(quán)重系數(shù)公式（3）計算出各測定性狀所占的比重，然后根據(jù)公式（4）算得加權(quán)關(guān)聯(lián)度，結(jié)果如表5所示，加權(quán)關(guān)聯(lián)度的排序和等權(quán)關(guān)聯(lián)度完全一致，這使得分析結(jié)果更為準(zhǔn)確，從而全面地反映了各品種在河西地區(qū)的表現(xiàn)優(yōu)劣，為新品種選育提供指導(dǎo)。

表5 7個甜葉菊品種與參考序列的關(guān)聯(lián)度Table5 Grey correlative degree among7 stevia varieties and reference number series

3 討論與結(jié)論

利用灰色關(guān)聯(lián)度分析對不同甜葉菊品種進(jìn)行綜合評價，克服樣本數(shù)量小、數(shù)據(jù)不充分的困難，解決僅依靠產(chǎn)量或品質(zhì)進(jìn)行單一因素評價的問題[14]，保證研究結(jié)果更加全面、準(zhǔn)確，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域及綜合評價方面得到了廣泛應(yīng)用[15]。

就評價因素而言，影響甜葉菊品種優(yōu)劣的因素主要有產(chǎn)量和品質(zhì)[16]，產(chǎn)量因素中葉片產(chǎn)量最為重要，甜葉菊葉片中含有多種不同的二萜糖苷類物質(zhì)[2]，每種物質(zhì)的含量、口感和甜度都各不一樣，其中RA市場需求量大，因此，在品質(zhì)因素中選用RA糖苷為評價因素，而同一植株不同葉位的含量存在差異，以植株中部含量最高[17]，因此取樣部位一致，樣品才具有代表性。

甜葉菊種質(zhì)RA含量的測定包括提取、分離和檢測3個步驟。每一個步驟都會影響最終結(jié)果。在提取葉片中的RA時，提取方法不同也會影響RA含量，如葉片的干燥方式，含水量以及提取液等[18-19]。液相色譜法是精確快速測定甜葉菊葉片中甜菊糖苷含量的理想方法[20-21]，甜菊糖苷的出峰時間會隨著流動相中有機試劑比例和流速的改變而改變，但不同甜菊糖苷的出峰順序只決定于色譜柱的類型[22]，同一樣品在不同的條件下檢測結(jié)果不同，而本研究所有樣品均是在同一條件下檢測，RA出峰時間約在7.6 min，因此可以進(jìn)行糖苷比較。本研究對7個甜葉菊品種采用灰色關(guān)聯(lián)度分析綜合評價得出，GY-23、GY26和GT-1分別位列第一、第二和第三位，可以作為甘肅河西地區(qū)甜葉菊新品種選育的優(yōu)良種質(zhì)資源，在今后的研究中作為重點。而GY-24、GY-25、GY-27、GY-28可以作為研究其他性狀的種質(zhì)材料，如蛇菊苷（STV）或萊鮑迪苷C（RC）等，為市場所需的專用品種建立種質(zhì)資源庫。為此，本研究對甜葉菊新品種選育提供了一定的理論指導(dǎo)，為大面積甜葉菊種植提供了參考依據(jù)。