肝細胞癌(HCC)是常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，在非洲和亞洲的發(fā)病率較高。HCC位居中國惡性腫瘤發(fā)病率的第3位，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率接近55%?，F(xiàn)有治療方法的長期效果尚不能令人滿意，HCC患者的復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移仍然呈升高趨勢[1]。因此，對疾病進展的生物標(biāo)志物的研究對優(yōu)化治療結(jié)果具有重要的意義。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞分化、基因表達調(diào)控、細胞周期調(diào)控、染色質(zhì)修飾和細胞核-細胞質(zhì)之間的運輸?shù)榷喾N功能，在腫瘤形成、預(yù)后標(biāo)志物作用、治療模式風(fēng)險預(yù)測等方面起著非常重要的作用[2]。SChLAP1是一種新型的前列腺癌標(biāo)志物，與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。Prensner首次報道SChLAP1是一個在前列腺癌的子集中過度表達并與致命疾病相關(guān)的lncRNA，涉及到腫瘤細胞的入侵和轉(zhuǎn)移[4]。本課題組的前期研究已經(jīng)證明SChLAP1與結(jié)直腸癌的預(yù)后明顯相關(guān)[5]。本研究通過檢測HCC及瘤旁組織中l(wèi)ncRNA-SChLAP1的表達情況，并分析其與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，從而闡明SChLAP1在HCC中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2008年4月至2014年6月丹東市第一醫(yī)院、沈陽市第五人民醫(yī)院行手術(shù)切除后經(jīng)病理學(xué)證實為HCC的92例腫瘤組織標(biāo)本(包括癌旁肝組織46例)。病理參數(shù)包括年齡、性別、腫瘤大小、門脈癌栓、TNM分期、肝硬化情況、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和甲胎蛋白(AFP)水平、無病生存時間及5年總生存率等。92例患者中，男性69例，女性23例；年齡為26～73歲，中位年齡為54歲；其中51例為早期(Ⅰ～Ⅱ)，41例為晚期(Ⅲ～Ⅳ)。92例患者手術(shù)前均未接受放射、化學(xué)治療，HCC患者術(shù)后隨訪5年，或直至死亡。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽屬了知情同意書。

1.2 RNA提取及實時定量PCR

使用試劑盒(TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，購自日本TaKaRa公司)根據(jù)制造商的指示提取組織樣本的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄酶引物合成第一鏈cDNA和低聚糖(dT)。取出2 μL產(chǎn)物進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95℃ 15s，60℃ 60s，40次循環(huán)，之后行3%瓊脂糖凝膠電泳[6]。應(yīng)用ChampChemi專業(yè)圖像分析系統(tǒng)(中國賽智公司)和Lane 1D凝膠成像分析軟件(中國賽智公司)對蛋白條帶進行量化。實時定量PCR實驗均為3次獨立樣本經(jīng)過3次獨立實驗后得到的數(shù)據(jù)，運用公式RQ=2-ΔΔCt進行分析。引物序列見表1。

表1 PCR反應(yīng)引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。HCC及癌旁組織中SChLAP1表達水平之間的比較、SChLAP1表達與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系比較用卡方檢驗和確切Fisher′檢驗；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法進行生存分析；Cox風(fēng)險回歸模型進行總生存期單因素及多因素分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SChLAP1在HCC組織中的表達及其與臨床參數(shù)的關(guān)系

實時定量PCR方法檢測結(jié)果顯示，SChLAP1在92例HCC組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 SChLAP1 在不同組織中的表達水平

以SChLAP1表達的中位數(shù)(4.452)作為分界點，將92例患者的SChLAP1表達水平分為高表達組55例和低表達組37例。HCC組織中SChLAP1的高表達率與腫瘤大小、有無門脈癌栓、臨床分期明顯相關(guān)，即SChLAP1在腫瘤較大、有門脈癌栓、Ⅲ～Ⅳ級的患者中表達水平較高。同時，SChLAP1的表達與患者的年齡、性別、是否有肝硬化、HBsAg和AFP的水平無相關(guān)性。見表2。

2.2 SChLAP1的表達與HCC患者的預(yù)后

應(yīng)用Kaplan-Meier繪制生存曲線，結(jié)果顯示SChLAP1高表達的患者的無病生存率和總生存率均明顯低于低表達者(無病生存率Log-rank=11.077，P=0.001；總生存率Log-rank=10.728，P=0.001，見圖2)。門脈未侵犯組、早期組和晚期組患者行組內(nèi)比較顯示，SChLAP1高表達者的無病生存率和總生存率均低于低表達者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3、圖4。但SChLAP1的表達水平在門脈已侵犯組內(nèi)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 SChLAP1的表達與HCC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

圖2 SChLAP1的表達水平對患者生存率的影響A無病生存率B總生存率

圖3 SChLAP1的表達水平在門脈未侵犯時對患者生存率的影響A無病生存率B總生存率

圖4SChLAP1的表達水平在不同臨床分期中對患者生存率的影響A早期患者無病生存率B早期患者總生存率C晚期患者無病生存率D晚期患者總生存率

Cox風(fēng)險回歸模型統(tǒng)計結(jié)果顯示，HCC中SChLAP1的高表達與臨床分期均是患者總生存率的獨立影響因子(P<0.01，見表2)。

表2 Cox回歸模型分析HCC患者預(yù)后影響因素

3 討論

lncRNA參與了多種生物學(xué)過程，包括多能干細胞重編程、致癌進展和細胞周期調(diào)控等，在導(dǎo)致疾病(包括腫瘤)進展的基因表達調(diào)控方面扮演著重要的角色。最近研究表明，lncRNA失調(diào)不僅會影響真核基因組的調(diào)節(jié)，而且還會給惡性細胞帶來生長優(yōu)勢，導(dǎo)致腫瘤進行性和不受控制性生長。HCC的起源和預(yù)后與lncRNA關(guān)系密切。Liu等[7]收集了162例HCC組織和癌旁組織，通過實時定量PCR檢測了lncRNA-HOST2的表達，結(jié)果顯示HCC組織中l(wèi)ncRNA-HOST2的表達較鄰近的正常組織升高了2～10倍。在人類HCC細胞系SMMC-7721中，lncRNA-HOST2能促進細胞增殖、遷移并抑制細胞凋亡；Xu等[8]證實了一種新的lncRNA-Myd88在體外和體內(nèi)均可促進HCC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，通過增強Myd88基因的啟動子，lnc-Myd88可以升高下游基因Myd88表達，導(dǎo)致核因子κB(NF-κB)和PI3k/ARKT信號通路激活。Wang等[9]報道，lncRNA-DILC介導(dǎo)了腫瘤壞死因子α(TNF-α)/NF-κB信號和自體分泌白細胞介素-6(IL-6)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)級聯(lián)反應(yīng)之間的串?dāng)_，并將肝臟炎性反應(yīng)與肝癌干細胞的擴增聯(lián)系起來，表明lncRNA-DILC可能不僅是一個潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物，還是針對肝癌干細胞的治療靶點。因此，lncRNA可能在HCC的演進過程中具有重要功能。

SChLAP1被命名為與前列腺-1相關(guān)的第2個染色體基因座，也稱為LINC00913。Prensner等[4]在前列腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，SChLAP1呈過表達，且可以作為患者預(yù)后不良的獨立風(fēng)險預(yù)測指標(biāo)，包括腫瘤的轉(zhuǎn)移和前列腺癌特異性死亡；同時，該研究通過體外及體內(nèi)功能獲得和功能缺失實驗表明，SChLAP1對SWI/SNF染色質(zhì)修飾的基因組定位和調(diào)控產(chǎn)生抵抗，阻斷了SWI/SNF復(fù)合物的抑癌功能，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致致死性腫瘤的進展。本研究結(jié)果顯示，HCC組織中SChLAP1 mRNA的表達水平明顯高于癌旁組織，且與腫瘤大小、門脈癌栓的形成及臨床分期等預(yù)后因素呈密切相關(guān)。生存分析結(jié)果表明，SChLAP1高表達的患者無病生存率及總生存率均明顯低于低表達的患者，提示SChLAP1對HCC的預(yù)后具有可靠的評估意義。門脈侵犯和臨床分期是HCC公認(rèn)的預(yù)后影響因子。本研究發(fā)現(xiàn)，在門脈未侵犯的患者中，高表達者的無病生存率和總生存率均明顯低于低表達者；無論是在早期還是晚期患者中，高表達者的無病生存率和總生存率均明顯低于低表達者，提示可以將SChLAP1、門脈侵犯與否及臨床分期聯(lián)合評估HCC的預(yù)后情況。經(jīng)Cox風(fēng)險回歸模型統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，SChLAP1的高表達和臨床分期均是影響HCC患者生存率的獨立風(fēng)險因素。因此，SChLAP1可以作為一個潛在的生物標(biāo)志物，起到對HCC預(yù)警以及治療靶標(biāo)的作用。

目前，對于HCC相關(guān)lncRNA及SChLAP1的研究仍然較少，它們在HCC細胞惡性演進過程中的作用機制需要研究者深入分析，尤其是對SChLAP1的進一步探索將為HCC預(yù)后評估和靶向治療提供新的生物標(biāo)志物。