王韋華，劉桂梅，吳奇強(qiáng)，郭抗抗

（1.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西渭南 714000；2. 渭南市動物疫病預(yù)防控制中心，陜西渭南 714000；3. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

豬瘟（classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的重大傳染病，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）須通報動物疫病[1]。該病以感染豬發(fā)病急、持續(xù)高熱、全身出血和白細(xì)胞減少為特征，發(fā)病率和死亡率都很高。國內(nèi)在以免疫為主的防控措施下，典型CSF的發(fā)生大大減少，往往以非典型出現(xiàn)，臨床癥狀出現(xiàn)多樣性，與其他疾病難以區(qū)分，僅靠傳統(tǒng)的臨床檢查、病理剖檢難以做出準(zhǔn)確診斷，需依靠實(shí)驗(yàn)室檢測才能確診[2]。常用的實(shí)驗(yàn)室檢測方法有病毒分離鑒定、免疫熒光檢測、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等。分子生物學(xué)檢測方法也有多種，包括逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、熒光定量RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增 技 術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等。分子生物學(xué)方法具有快速、敏感、特異的明顯優(yōu)勢，其中LAMP技術(shù)由于檢測條件要求較低，在病原快速檢測方面得到廣泛應(yīng)用。LAMP技術(shù)是Notomi等2010年發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。該方法針對目的基因設(shè)計(jì)6條特異性引物，依賴一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下特異、快速、高效、靈敏擴(kuò)增靶基因序列[3]。LMAP檢測技術(shù)在動物疫病病原體檢測領(lǐng)域研究眾多：鄭書軒等[4]、許宗麗等[5]分別基于偽狂犬病病毒（pseudo rabies virus，PRV）的保守基因片段設(shè)計(jì)特異性引物建立了快速檢測PRV方法；陳希文等[6]針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的ORF5基因片段設(shè)計(jì)了4條引物，建立檢測PRRSV的RT-LAMP方法；湯小真等[7]設(shè)計(jì)了一套基于豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）NP基因的特異性引物，在反應(yīng)體系中加入了鈣黃綠素指示劑代替SYBR GreenⅠ染料，建立了基于鈣黃綠素檢測PEDV的可視化LAMP方法；周玉鵬等[8]基于日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）的Ⅰ型和Ⅲ型基因序列設(shè)計(jì)了RT-LAMP特異性引物，建立了用于快速檢測JEV的方法。朱俊靈等[9]將LAMP與橫向流動試紙條技術(shù)（lateral flow dipstick，LFD）相結(jié)合，設(shè)計(jì)了一套針對CSFV NS5B基因的特異性引物及生物素標(biāo)記探針，其能結(jié)合異硫氰酸熒光素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而建立了RT-LAMP-LFD檢測方法；鄧顯文等[10]建立的可視化檢測CSFV及特異性鑒別CSFV兔化弱毒疫苗株（HCLV）的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)，為臨床檢測CSFV野毒株及特異性鑒別HCLV毒株提供了技術(shù)支持。這些方法的應(yīng)用為CSFV檢測提供了可靠的依據(jù)，但由于一般實(shí)驗(yàn)室不具備相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件，使得這些方法難以推廣應(yīng)用[11]。

為此，本研究利用RT-LAMP技術(shù)，針對CSFVNS5B基因設(shè)計(jì)了1組特異性檢測CSFV的引物，并對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了適用于一般實(shí)驗(yàn)室快速準(zhǔn)確檢測CSFV的方法。

1 材料與方法

1.1 病毒株和臨床樣品

滅活的CSFV Shimen株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等：西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)公共衛(wèi)生與畜禽產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室保存；CSFV兔化弱毒疫苗（HCLV）：中牧實(shí)業(yè)股份公司產(chǎn)品；豬細(xì)小病病毒（porcine parvovirus，PPV）疫苗：山東華宏生物工程有限公司產(chǎn)品；PRV疫苗：青島易邦生物工程有限公司產(chǎn)品；JEV疫苗：武漢科前生物股份有限公司產(chǎn)品。

臨床樣品：采自陜西及周邊省份（甘肅、寧夏）8個地區(qū)的100份臨床樣品，包括扁桃體、淋巴結(jié)、肺臟、腎臟組織各10份，血清60份（表1）。組織樣品為出現(xiàn)臨床癥狀，但未確診疾病的豬組織；血清樣品包括臨床發(fā)病和健康豬的血清。所有樣品均在-80 ℃保存。

1.2 主要試劑

Trizol試劑：寶生物（大連）工程有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒：北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司產(chǎn)品；RT-LAMP試劑：康為世紀(jì)有限公司產(chǎn)品；SYBR GreenⅠ核酸染料：購自格里斯醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)公司；RTPCR試劑：北京天跟生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 病毒核酸提取和cDNA合成

按照Trizol試劑說明書，分別提取CSFV、TGEV、JEV、PRRSV等RNA病毒核酸，提取總RNA進(jìn)行濃度測定，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備cDNA。按照DNA提取試劑盒說明書，分別提取PPV和PRV等的總DNA。

表1 臨床樣品檢測來源 單位：份

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank中6株CSFV全基因序列（ 登 錄 號 JX898524、KY860532、KX586773、KX431227、KU375262、KU375259）， 用 在 線軟件MegAlign篩選各毒株共同保守的基因區(qū)段（NS5B基因區(qū)段），然后用Primer Explorer V5（http://primer explorer.jp/e/），針對NS5B基因保守區(qū)設(shè)計(jì)LAMP引物，包括2個外部引物（F3/B3）和2個內(nèi)部引物（FIP/BIP）。引物序列如表2所示，由西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司合成。

表2 CSFV RT-LAMP引物

1.5 反應(yīng)體系構(gòu)建

RT-LAMP的基本反應(yīng)體系（25 μL）：包括BstDNA 聚 合 酶 10 U，Betaine（5 μmoL/μL）1 μL，dNTPs（10 mmol/L）3.5 μL，MgSO4（100 mmol/L）1.5 μL，10×Themopol Reaction Buffer 2.5 μL， 外 引 物（F3/B3，10 pmol/μL） 各0.5 μL， 內(nèi) 引物（FIP/BIP，10 pmol/μL）各4.0 μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶5 U，2 μL RNA模板。反應(yīng)條件：63.5 ℃恒溫作用1 h。

在LAMP基本的反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，設(shè)置不同AMV酶使用濃度（2.5、5.0、7.5、10 U）、不同dNTPs使用濃度（0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L）及不同的反應(yīng)溫度（59、61、63、65 ℃），分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。探究各個因素對RT-LAMP試驗(yàn)結(jié)果的影響，獲得最佳反應(yīng)參數(shù)，建立最佳CSFV RT-LAMP檢測體系。

1.6 擴(kuò)增特異性及產(chǎn)物檢測

酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)檢測擴(kuò)增條帶。白色沉淀檢測：RT-LAMP反應(yīng)后，根據(jù)反應(yīng)液中是否出現(xiàn)白色沉淀判定擴(kuò)增與否。SYBR GreenⅠ核酸染料檢測：RT-LAMP反應(yīng)后，加入1 μL SYBR GreenⅠ核酸染料，若反應(yīng)液立即變綠，說明反應(yīng)為陽性；若未變綠，則為陰性。在紫外燈下觀察，發(fā)出白色熒光的為陽性，無熒光為陰性。

1.7 特異性檢測

以 PRRSV、PPV、PRV、TGEV和 JEV核酸為模板，以CSFV LAMP引物，分別進(jìn)行RTLAMP檢測，以各病毒引物進(jìn)行RT-PCR檢測，分析其特異性。其中，CSFV引物由西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)公共衛(wèi)生與畜禽產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室建立[11]，其他病毒的引物見表3。

表3 各病毒引物信息

1.8 敏感性檢測

以10-1、10-2、......、10-12稀釋度的CSFV核酸為模板，分別進(jìn)行RT-LAMP、RT-PCR檢測，分析RT-LAMP的靈敏性。

1.9 臨床樣品檢測

對從豬場收集的100個樣品，分別進(jìn)行CSFV RT-PCR和RT-LAMP檢測，其中扁桃體、淋巴結(jié)、肺臟、腎臟組織各10份，血清樣品60份。采用Trizol法提取病料的總RNA，同步進(jìn)行RTLAMP、RT-PCR檢測，評價RT-LAMP在臨床樣品中的應(yīng)用效果。

2 結(jié)果

2.1 RT-LAMP檢測方法的建立

通過分別設(shè)置不同的AMV反轉(zhuǎn)錄酶濃度、dNTPs濃度和反應(yīng)溫度，獲得了最佳反應(yīng)參數(shù)：低AMV反轉(zhuǎn)錄酶濃度時可得到清晰圖譜，但泳帶較淺，擴(kuò)增效率低，10 U時擴(kuò)增效率為最佳（圖1-A）；dNTPs濃度為1.4 mmol/L時，電泳條帶最清晰，擴(kuò)增效率最高（圖1-B）；BstDNA聚合酶最佳活性溫度為63 ℃（圖1-C），故選63 ℃作為LAMP的擴(kuò)增溫度。

綜上所述，最佳CSFV RT-LAMP檢測體系為25 μL：BstDNA 聚合酶 10 U，Betaine（5 μmoL/μL）1 μL，dNTPs（10 mmol/L）3.5 μL，MgSO4（100 mmol/L）1.5 μL，10×Themopol Reaction Buffer 2.5 μL，外引物（F3/B3，10 pmol/μL）0.5 μL， 內(nèi) 引 物（FIP/BIP，10 pmol/μL）4.0 μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶10 U，2 μL RNA模板。反應(yīng)條件：63 ℃恒溫 1 h。

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

瓊脂糖凝膠電泳法、SYBR GreenⅠ熒光法和白色沉淀法分別檢測RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物。RTLAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳圖譜上呈梯狀（圖2-A），說明是特異性擴(kuò)增。白色沉淀法檢測中，其中一管出現(xiàn)白色沉淀（圖2-B），為陽性；而另一管為透明色，為陰性。通過SYBR GreenⅠ熒光檢測，一管呈現(xiàn)綠色（圖2-C），為陽性；另一管為橘黃色，為陰性。在紫外燈下觀察，發(fā)出白色熒光的為陽性（圖2-D），無熒光為陰性。另外，多次試驗(yàn)結(jié)果表明，白色沉淀法在目標(biāo)核酸量較低時，結(jié)果判定容易發(fā)生誤判，3種方法中最方便可靠的是SYBR GreenⅠ核酸染料檢測法。

圖1 CSFV RT-LAMP檢測方法的優(yōu)化結(jié)果

2.3 特異性檢測

用所建立的RT-LAMP方法分別檢測CSFV Shimen株、CSFV檢測血清陽性樣品、HCLV、PRRSV、TEGV、JEV的RNA，以及PRV、PPV的DNA，結(jié)果僅在CSFV檢測管中出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，其他管中均未見擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)（圖3-A）。向反應(yīng)管中加入1 μL SYBR GreenⅠ核酸染料，觀察到CSFV管清晰的橙黃色，其余為淺綠色（圖3-B）。在紫外燈下觀察觀察到CSFV管中能發(fā)出熒光，而其余的不能（圖3-C）。

同時，設(shè)立這5種病毒的特異性引物并進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果如圖3-D?？梢钥吹紺SFV Shimen株、CSFV檢測血清陽性樣品、HCLV樣品在441 bp的位置出現(xiàn)條帶，而JEV、TGEV、PRRSV、PRV、PPV 分 別 在 375、276、400、700、445 bp的位置出現(xiàn)條帶，證明這5種病毒均為陽性。

圖2 不同RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法的選擇檢測結(jié)果

2.4 靈敏性檢測

由圖4-A可以看出，RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物隨著RNA濃度的降低，條帶亮度先變亮，然后亮度逐漸減弱，RNA檢測的最低濃度為1.58×10-7ng/μL。由圖4-B可以看出，隨著RNA濃度的降低，RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物逐漸減弱。檢測的最低模板RNA濃度為1.58×10-5ng/μL。RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物和 RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物的剩余部分加入核酸熒光染料用于肉眼觀察，可見1～9管的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)明顯的黃綠色，10管為淺綠色，11、12、13管為淡橙色（圖4-C）；與電泳檢測結(jié)果相符。在紫外燈下觀察，可見1～9管的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)出明顯的熒光，10、11、12和13管沒有熒光（圖4-D）。

圖3 CSFV RT-LAMP特異性檢測結(jié)果

特異性反應(yīng)中加入SYBR GreenⅠ核酸染料可視化觀察和紫外燈照射觀測的最低檢測濃度與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致，用于RT-LAMP測定和RT-PCR測定的模板RNA最小可檢測濃度分別為1.58×10-7和 1.58×10-5ng/μL，表明 RT-LAMP 測定方法比RT-PCR測定方法更靈感。

圖4 CSFV RT-LAMP靈敏性檢測結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測

采用本研究建立的RT-LAMP檢測方法和已建立的CSFV RT-PCR檢測方法[12-13]，對從豬場收集的100個樣品分別進(jìn)行CSFV的RT-PCR和RTLAMP檢測，其中扁桃體、淋巴結(jié)、肺臟、腎臟組織各10份，血清樣品60份。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，100份樣品中，有10份樣品擴(kuò)增后和預(yù)期片段大小相匹配。RT-LAMP檢測結(jié)果顯示，100份樣品中，有13份樣品RT-LAMP檢測為陽性，其中10份檢測結(jié)果與RT-PCR一致，另外3份檢測結(jié)果與RTPCR不同。樣品RT-PCR檢測陽性率為10.0%，RT-LAMP檢測陽性率為13.0%，表明RT-LAMP方法比RT-PCR方法具有更高的檢出率。RT-PCR和RT-LAMP臨床部分樣品檢測結(jié)果見圖5。

圖5 RT-PCR和RT-LAMP臨床部分樣品檢測結(jié)果

3 討論

根據(jù)反應(yīng)條件不同，核酸擴(kuò)增技術(shù)可以分為兩大類：非等溫擴(kuò)增技術(shù)和等溫擴(kuò)增技術(shù)，分別以PCR和LAMP為代表。LAMP操作簡單、快速、靈敏度高，不僅適用于實(shí)驗(yàn)室檢測，也適用于基層、場區(qū)現(xiàn)場檢測。該技術(shù)自發(fā)明以來引起各國科學(xué)家的關(guān)注，正在進(jìn)行更深入的研究和條件探索，已廣泛用于病原微生物檢測、動物胚胎性別分化、轉(zhuǎn)基因食品檢測等，具有很好的前景。

LAMP技術(shù)具有特異、敏感、擴(kuò)增條件要求低等優(yōu)點(diǎn)，在動物病原檢測方面有著廣闊的應(yīng)用前景。閆興華等[14]運(yùn)用LAMP建立了對轉(zhuǎn)基因玉米（Zea maysL.）LY038外源基因的快速檢測技術(shù)。該方法依據(jù)cordap A基因序列設(shè)計(jì)了4條特異性引物，結(jié)果表明引物特異性良好。該檢測體系在63 ℃恒定溫度下，反應(yīng)50 min，可檢測到0.01%的樣本，是常規(guī)PCR方法的5倍。潘宏等[15]分別設(shè)計(jì)了水牛SRY基因和12SrRNA基因雄性特異性引物用于LAMP法胚胎性別鑒定，同時用PCR對LAMP法鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明優(yōu)化的LAMP法對水牛早期胚胎性別鑒定的準(zhǔn)確率與檢出率均為100%，檢測靈敏度為2×10-5ng。Poon等[16]將提取的禽流感病毒稀釋成不同的濃度，分別用PCR和LAMP方法進(jìn)行檢測，在1 h內(nèi)LAMP方法檢測最低下限為10-3PFU，而PCR為10-2PFU，說明LAMP方法敏感性比PCR高，而且反應(yīng)過程中所生成的白色沉淀物可以通過肉眼觀察；Ono等[17]根據(jù)新城疫病毒融合蛋白基因設(shè)計(jì)了RT-LAMP特異性引物，建立了新城疫病毒檢測方法，同時直接對分離培養(yǎng)物和臨床樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其靈敏度和特異性與套式PCR一致；高志強(qiáng)等[18]針對PEDVM基因設(shè)計(jì)了一套引物，建立了可特異性擴(kuò)增PEDV的RT-LAMP可視化檢測方法。范晴等[19]根據(jù)口蹄疫病毒（FMDV）3D基因和水泡性口炎病毒（VSV）N基因保守序列，設(shè)計(jì)了2套特異性引物，在每套引物的內(nèi)引物中插入酶切位置EcoRⅠ，對反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了恒溫快速的檢測方法。李健等[20]根據(jù)CSFV多聚蛋白基因保守區(qū)段設(shè)計(jì)了RT-LAMP特異性引物，發(fā)現(xiàn)建立的方法能夠以10-5的稀釋度檢測靶標(biāo)病毒核酸，比普通RT-PCR靈敏100倍，比real-time RT-PCR高10倍。孫興娟等[21]建立了CSFV野毒株RT-LAMP可視化檢測方法，發(fā)現(xiàn)該方法具有LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的高效率性和LFD方法的簡單性，可以在幾分鐘內(nèi)讀取結(jié)果。上述建立的兩種檢測方法靈敏，可與RT-PCR相媲美。熊煒等[22]建立了豬肺炎支原體LAMP檢測方法，通過在LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色液，提高了檢測結(jié)果肉眼判定的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)了結(jié)果判定可視化的目標(biāo)，有助于出入境口岸貨物查驗(yàn)現(xiàn)場及豬場中豬肺炎支原體的檢測。蘭德松等[23]根據(jù)CSFV基因組的NS5B基因片段，針對NS5B基因6個位點(diǎn)設(shè)計(jì)了4條RT-LAMP擴(kuò)增引物，發(fā)現(xiàn)建立的方法能特異性檢出CSFV，而PRV、PPV、PRRSV、PCV、FMDV等病毒擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。該方法與CSF熒光RT-PCR方法相比，其特異性無明顯差異，而敏感性卻高10倍。

本試驗(yàn)建立的最優(yōu)RT-LAMP體系的分析檢測限為1×10-7拷貝的CSFV，比基于凝膠的一步反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）靈敏度高約100倍。優(yōu)化后的RT-LAMP體系可特異性擴(kuò)增CSFV Shimen株、CSFV檢測血清陽性樣品、HCLV，并可與TGEV、PPV、PRV、JEV和PRRSV相互鑒別。通過篩選一組臨床標(biāo)本（N= 100），發(fā)現(xiàn)該方法特異性與RT-PCR保持一致，而靈敏度卻比RTPCR高100倍。本試驗(yàn)中使用了SYBR GreenⅠ核酸染料，肉眼便可觀察到顏色變化，并可通過肉眼觀察到顏色變化來判定結(jié)果；在紫外燈下觀察，陽性樣品出現(xiàn)強(qiáng)烈熒光，陰性則無。此外，對RTLMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測的方法有3種，包括凝膠電泳檢測法、白色沉淀檢測法和熒光檢測法。多次試驗(yàn)表明，白色沉淀法在目標(biāo)核酸量較低時，容易出現(xiàn)誤判，凝膠電泳檢測法有一定的實(shí)驗(yàn)條件限制，而在RT-LAMP反應(yīng)液中加入SYBR GreenⅠ核酸染料，可在幾分鐘內(nèi)觀察到結(jié)果，且與凝膠電泳結(jié)果一致，故最方便可靠的是熒光檢測法。

在RT-LAMP體系中，通過對dNTPs濃度、AMV反轉(zhuǎn)錄酶濃度以及擴(kuò)增溫度3個因素進(jìn)行優(yōu)化，即可獲得理想的試驗(yàn)結(jié)果。本試驗(yàn)是基于RTLAMP技術(shù)操作方便、快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)建立了CSFV可視化單管一步RT-LAMP檢測方法，用以診斷和監(jiān)測CSFV感染，從而為CSF的現(xiàn)場快速診斷提供了一種更加簡便的方法。