劉 健，李 鑫，葛菲菲，楊德全，沈海瀟，鞠厚斌，葛 杰，于諱茹、鄧 波、王 建，趙洪進(jìn)

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

馬皰疹病毒（equine herpesvirus，EHV）屬于馬皰疹病毒科，共有9個(gè)成員（EHV-1～EHV-9），其 中 EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8和 EHV-9屬于α皰疹病毒亞科[1]。EHV-1和EHV-4又稱馬鼻肺炎病毒，是嚴(yán)重危害養(yǎng)馬業(yè)的主要傳染病病原之一，流行于全球40多個(gè)國家和地區(qū)[2]。從致病性角度來看，EHV-1主要引起妊娠馬流產(chǎn)以及神經(jīng)性疾病和呼吸系統(tǒng)疾病，而EHV-4主要引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病[3]。

本研究采用EHV-1和EHV-4普通分型PCR方法，對上海市某馬場疑似臨床病例的鼻拭子和抗凝血樣品進(jìn)行檢測，并對陽性樣品進(jìn)行測序比對，最終確診為EHV-1型感染。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

馬鼻拭子樣品5份、抗凝血3份，均來源于上海市某馬場疑似臨床癥狀馬匹。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶：批號A4201A，購自寶生物工程（大連）公司；DNA提取試劑盒：批號MD5416-01，購自Magen生物公司。

1.3 合成引物

根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]合成引物。EHV-1上游引物 EHV-1-F：5'-CTTTAGCGGTGATGTGGA-3'。E H V-1下 游 引 物 E H V-1-R：5'-GTTTGTGCAAGCGATGTAGA-3'。EHV-4上 游引物 EHV-4-F：5'-GTCAACCCAGTCCGCTAA-3'；E H V-4下 游 引 物 E H V-4-R：5'-GGCATCCATCCGACATAA-3'。

1.4 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序

PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：模板 10 μL，引物（20 pmol/L） 各 1 μL，10×Buffer 5 μL，TaqDNA 聚合酶 0.2 μL，加 ddH2O 補(bǔ)足至 50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳鑒定。EHV-1目的片段大小為265 bp，EHV-4為 537 bp。

1.5 序列測定和比對

將出現(xiàn)特異性條帶的PCR產(chǎn)物，送桑尼生物有限公司測序，并將序列與參考序列進(jìn)行比對，確定陽性條帶的病毒亞型。參考序列來源：肯塔基株（GenBank登錄號AB279609）、日本株（GenBank登錄號 KF644571）、英國株（GenBank 登錄號AY665713和M36298）和德國株（GenBank 登錄號X95377）。

2 結(jié)果

2.1 EHV-1和EHV-4擴(kuò)增

以病毒DNA為模板，利用特異性引物，通過PCR方法在5號棉拭子樣品（SS-5）中擴(kuò)增出265 bp的特異性條帶（圖1），其大小與EHV-1目的片段一致，未出現(xiàn)EHV-4目的條帶及其他非特異條帶。

2.2 擴(kuò)增片段核苷酸同源性分析

將陽性樣品擴(kuò)增序列與已知gB參考序列進(jìn)行比對，獲得核苷酸序列的同源性（表1）。比對結(jié)果表明，陽性樣品序列與參考毒株序列同源性在95.6%～96.4%之間，可以判定陽性樣品屬于EHV-1型。

圖1 待檢樣本擴(kuò)增結(jié)果

表1 陽性樣品SS-5與參考毒株gB序列核苷酸同源性分析結(jié)果

2.3 EHV-1遺傳進(jìn)化樹分析

應(yīng)用DNAstar分析軟件，比對SS-5擴(kuò)增序列與GenBank中5個(gè)已經(jīng)公開的EHV-1gB序列。通過Clust-alX1.83分子生物學(xué)軟件，比較分析并用MEGA3.1繪制了基因組進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果顯示，SS-5與其他參考株同源性關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 SS-5基因進(jìn)化樹

3 討論

EHV-1和EHV-4具有皰疹病毒甲亞科典型的生物學(xué)特征，從而引起相應(yīng)的流行病學(xué)特征，如青年馬易感，但發(fā)病率低，潛伏感染的帶毒馬比例較高，并經(jīng)常排毒，不間斷傳播給新的易感動(dòng)物，從而導(dǎo)致疫病流行[5]。根據(jù)流行病學(xué)、臨診癥狀、流產(chǎn)胎兒病變，尤其是嗜酸性核內(nèi)包涵體等，可對馬鼻肺炎作出初步診斷[6]。但EHV-1和EHV-4感染引起的馬鼻肺炎容易與其他病原導(dǎo)致的上呼吸道感染、流產(chǎn)或神經(jīng)性疾病相混淆，因此不能只依賴于臨床癥狀來診斷，還需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測來確診[7-8]。本研究采集具有疑似臨床癥狀馬的鼻拭子樣品和血漿樣品進(jìn)行EHV-1和EHV-4分型檢測，發(fā)現(xiàn)第5號鼻拭子樣品為EHV-1陽性，表明上海市馬群中存在EHV-1感染，并引起了相應(yīng)的臨床癥狀。

EHV-1在我國分布較廣，馬匹一旦感染可終生帶毒。病馬和康復(fù)帶毒馬是本病的傳染源?？祻?fù)帶毒馬如果受斷奶、運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激因素刺激，潛伏的EHV-1會(huì)再次被激活，導(dǎo)致發(fā)病[9]。本病主要通過空氣傳播，呼吸道是EHV-1的主要入侵門戶，消化道和交配也可傳染。因此，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和疫苗接種是預(yù)防和控制EHV-1感染的主要方法，包括嚴(yán)格遵守衛(wèi)生防疫標(biāo)準(zhǔn)，定期對馬廄進(jìn)行消毒，注意飲食來源等。同時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)對妊娠母馬的飼養(yǎng)與衛(wèi)生管理，包括分群飼養(yǎng)、隔離檢疫、小群飼養(yǎng)、避免應(yīng)激和陽性馬隔離等[10-11]。EHV-1疫苗雖然無法根除EHV-1，但可有效減少EHV-1引起的呼吸道感染癥狀和母馬流產(chǎn)癥狀[12]，因此應(yīng)定期進(jìn)行EHV-1疫苗免疫。