李云龍 王寶英 常亞鋒 續(xù)勇波 黃新琦，3，4 張金波，3，4蔡祖聰，3，4 趙 軍，3，4?

（1 南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，南京 210023）

（2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，昆明 650201）

（3 江蘇省地理信息資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023）

（4 南京師范大學(xué)，江蘇省物質(zhì)循環(huán)與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023）

三七[Panax notoginseng（Burk.）F. H.Chen］，又名田七，為五加科人參屬多年生草本植物，是我國特有的名貴中藥材，具有活血化瘀、消腫定痛等功效[1］。三七市場需求量大，僅國內(nèi)就有1300多家企業(yè)以三七為原料生產(chǎn)400多個(gè)藥品，幾乎涵蓋了所有的中藥制藥企業(yè)[2］。因此，道地三七的可持續(xù)生產(chǎn)是保證我國中藥產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的關(guān)鍵之一。然而，三七既喜陰濕，又是宿根植物，極易被土壤中的病原菌侵染發(fā)病。其中根腐病是三七生長過程中最為嚴(yán)重的病害，致病因素復(fù)雜，主要是細(xì)菌和真菌混合致病，常年發(fā)病率為5%～20%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70%[3］。尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）是三七根腐病的主要致病菌，專性寄生，在無寄主植物存在時(shí)，其休眠孢子仍能在土壤中存活長達(dá)20年之久。此外，三七在生長過程中通過自然揮發(fā)、雨霧淋溶、根系分泌和植株分解等方式向環(huán)境中釋放的化感物質(zhì)是引起土壤微生物區(qū)系失衡，刺激病原菌快速生長，導(dǎo)致三七生長不良、發(fā)病和死亡的重要因素之一[4］。其中，皂苷類物質(zhì)是三七主要的次生代謝產(chǎn)物，在植物根與病原菌的互作中扮演著重要的角色，被認(rèn)為是導(dǎo)致三七連作障礙的主導(dǎo)因素[5］。

目前，科學(xué)上消減三七連作障礙的主要途徑包括農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治[6］。輪作和間作是緩解作物連作障礙較為有效的傳統(tǒng)方法[7-8］，但三七的忌地性極強(qiáng)，往往需要輪作10～30年才能再植，而且隨著種植歷史的延長，可種植三七的土地資源日益匱乏，因此輪作已無法滿足道地三七可持續(xù)生產(chǎn)對土地資源的需求[6］。而土壤化學(xué)熏蒸劑是目前生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛的方法，但其作用單一，僅能夠殺滅土傳病原菌，不能改良土壤理化性狀和消除化感物質(zhì)[9］，而且土壤中病原菌的數(shù)量在再植作物根系分泌物的誘導(dǎo)下會迅速回升[10］，對多年生喜陰濕的宿根植物三七的連作障礙防控效果不佳。利用外源添加有益微生物來防控三七連作障礙的效果往往不穩(wěn)定，這與添加的有益微生物能否適應(yīng)土壤環(huán)境并存活下來發(fā)揮其作用有關(guān)[11］。綜上所述，至目前為止，科學(xué)研究或農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上并沒有有效消減三七連作障礙因子、實(shí)現(xiàn)三七可持續(xù)生產(chǎn)的綜合農(nóng)業(yè)措施。

土壤強(qiáng)還原處理（Reductive soil disinfestation，RSD）是一種作物種植前的土壤處理方法，其操作簡單，處理時(shí)間短，不耽誤農(nóng)時(shí)，具有殺滅土傳病原菌，改善土壤結(jié)構(gòu)，重建土壤微生物區(qū)系的多重效應(yīng)，從而能夠有效緩解蔬菜和花卉的連作障礙現(xiàn)象[12-13］。本研究利用云南省文山苗鄉(xiāng)三七科技有限公司搭建的“三七連作障礙PK試驗(yàn)平臺”內(nèi)的試驗(yàn)地，研究高碳氮比、低碳氮比和高、低碳氮比等質(zhì)量混合有機(jī)物料RSD處理對連作三七土壤障礙因子尤其是化感物質(zhì)和土傳病原菌、微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性及三七存苗率和發(fā)病率的影響，并進(jìn)一步探討土壤中連作障礙因子消減程度與三七存苗率和發(fā)病率的關(guān)系，旨在尋求一種快速消減不同連作障礙因子的綜合措施，以期為消減和克服三七連作障礙、實(shí)現(xiàn)道地三七可持續(xù)生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

田間試驗(yàn)位于云南省文山苗鄉(xiāng)三七科技有限公司的“三七連作障礙PK試驗(yàn)平臺”（23°42′N,104°16′E），屬亞熱帶氣候，冬無嚴(yán)寒，夏無酷暑。年均氣溫15～17 ℃，降雨量為1 100～1 319 mm，全年無霜期356d。試驗(yàn)前該P(yáng)K地已連續(xù)六年種植三七，自從第一次移栽一年七籽條并存活至收獲（三年七）以后，此后每年移栽的一年七籽條均在當(dāng)年全部發(fā)病死亡[14］。試驗(yàn)前0～20 cm土層的基本理化性質(zhì)為pH 7.12，電導(dǎo)率 0.09 mS·cm-1，有機(jī)質(zhì)和全氮的含量分別為10.52和0.36 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)共設(shè)置四個(gè)處理：1）不做任何土壤處理的對照（CK）；2）添加高碳氮比有機(jī)物料的RSD處理（TOC：442.4 g·kg-1，TN：4.66 g·kg-1，C/N 94，SB）；3）添加低碳氮比有機(jī)物料的RSD處理（TOC：451.2 g·kg-1，TN：22.9 g·kg-1，C/N 19，BD）；4）添加高、低碳氮比等質(zhì)量混合有機(jī)物料的RSD處理（m/m=1∶1，SB+BD）。RSD處理的具體操作如下：在連作三七土壤表面均勻添加15 t·hm-2有機(jī)物料后通過旋根機(jī)將其與耕作層土壤混合均勻，灌溉至田間最大持水量并覆膜處理40 d，處理期間土壤溫度為20～30 ℃。各處理包含兩壟，分成三個(gè)生物學(xué)重復(fù)區(qū)。每壟面積30 m2（2 m × 15 m），各壟之間由40 cm深，20 cm寬的溝隔開。

1.3 土壤樣品采集及預(yù)處理

待RSD處理結(jié)束后，揭開薄膜，采集土壤樣品。各處理每個(gè)小區(qū)按“S”形采樣路線隨機(jī)選取10個(gè)采樣點(diǎn)，采集0～20 cm的耕層土壤，混合均勻后去除雜物和細(xì)根，過2 mm篩。過篩后的新鮮土壤樣品分成三份：一份風(fēng)干后測定皂苷類化感物質(zhì)；一份保存在4℃用于測定土壤微生物活性；一份保存在-80℃用于土壤基因組DNA的提取。

1.4 土壤皂苷類化感物質(zhì)的測定

土壤中皂苷類化感物質(zhì)的提取參照Ya n g等[15］的方法并作適當(dāng)調(diào)整。稱取50 g風(fēng)干土樣（100目）三份，分別置于1 L的三角瓶中，加入600 mL 100%甲醇（土/甲醇=1∶12，m/v）搖床過夜提取（30 ℃，220 r·min-1），然后超聲提取2 h（35 ℃，45 KHz）后離心（3 000 r·min-1，3 min）并收集上清液，下層土壤再重復(fù)提取2次，離心后合并3次上清液，將所有上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干（30 ℃），稱重后再用一定量的色譜甲醇溶解，0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾后將濾液置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rh1、Rb3、Rd（購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司）各1 mg，加入一定量甲醇溶解配制成每1 mL分別含0.1 mg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，所得標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.45 μm有機(jī)系濾膜過濾后各吸取1 mL配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。土壤中皂苷類化感物質(zhì)提取液按照上述方法提取。利用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）Waters e2695 系統(tǒng)的PDA檢測器對土壤中的皂苷進(jìn)行測定，色譜柱為Waters C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動相由乙腈（A）和水（B）組成，0～30 min用18%A和82%B洗脫，30～35 min用30%A和70%B洗脫，35～55 min用35%A和65%B洗脫，55～77 min用18%A和82%B洗脫；流速1.5 mL·min-1；波長203 nm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量30 μL。

1.5 土壤微生物活性的測定

土壤中微生物活性的測定參照A d a m和Duncan[16］的方法。稱取過 2 mm 篩的鮮土 2 g，置于 50 mL 離心管中，分別加入 15 mL 磷酸緩沖液（60 mmol·L-1，pH 7.6）和 0.2 mL FDA 溶液（1 mg·mL-1），用封口膜封口，在30 ℃、100 r·min-1條件下反應(yīng) 20 min，結(jié)束后立即加入 15 mL氯仿/甲醇（2∶1）溶液終止反應(yīng)，2 000 r·min-1離心 3 min 后取上清液過 0.22 μm 有機(jī)系濾膜，濾液用分光光度計(jì)在 490 nm 處測定吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線參照Zhao等[14］的方法構(gòu)建。

1.6 土壤DNA提取及熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析

稱取0.5 g置于-8 0 ℃冰箱中的土壤，用PowerSoil?DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA) 按說明書上的步驟進(jìn)行土壤總 DNA的提取，所有DNA樣品保存在-20 ℃冰箱待用。

用于定量細(xì)菌1 6 S r R N A（E u b 3 3 8 F/Eub518R）、真菌（ITS1f/5.8S）和尖孢鐮刀菌ITS基因（ITS1F/AFP308R）的引物如表1所示。熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)在CFX96TMReal-Time System（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA，USA）上進(jìn)行。各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線參照Zhao等[17］的方法構(gòu)建。

1.7 變性梯度凝膠電泳及DGGE圖譜分析

分別利用帶有GC夾子的細(xì)菌通用引物GCU968/L1401和真菌通用引物 GC-Fung/NS1對細(xì)菌和真菌的16S rRNA和18S rRNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1）。參照Muyzer等[19］的方法，采用D-Code System（Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules,CA, USA）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳（Denatured gradient gel electrophoresis, DGGE）分析。細(xì)菌和真菌的變性梯度、電泳條件和凝膠染色顯影參照劉亮亮等[26］的方法。利用Quantity One 4.6.3對DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析和多樣性分析。

1.8 三七存苗率和發(fā)病率的測定

一年七籽條于正常種植時(shí)間移栽至各處理土壤中，移栽3個(gè)月后（三七籽條出苗完全）統(tǒng)計(jì)其出苗率，移栽5個(gè)月和8個(gè)月后統(tǒng)計(jì)存苗率和發(fā)病率。計(jì)算公式如下：

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)為單因素試驗(yàn)，采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素方差（One-way ANOVA）配合Tukey’s HSD檢驗(yàn)多處理間均值差異的顯著性；Pearson相關(guān)性分析檢驗(yàn)土壤中化感物質(zhì)含量、病原菌數(shù)量與三七出苗率、存苗率、發(fā)病率及微生物多樣性和豐富度之間的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 不同有機(jī)物料RSD處理對土壤中皂苷含量和降解率的影響

利用HPLC結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的方法分析不同處理土壤提取液中的皂苷成分（圖1），結(jié)果顯示，土壤提取液中可檢測出2種主要的皂苷成分，即Rb1和Rh1。結(jié)合表2可知，與CK處理相比，RSD處理均能顯著降低土壤中皂苷Rb1和Rh1的含量（P≤0.05），其中BD和SB+BD處理對Rb1的降解效果顯著優(yōu)于SB處理（P≤0.05），降解率均高達(dá)82%；而SB、BD和SB+BD處理對Rh1的降解效果很好，降解率分別為85.4%、85.8%和88.1%，但不同RSD處理間無顯著差異（P＞0.05）。土壤強(qiáng)還原處理能夠顯著降低土壤中皂苷類化感物質(zhì)的含量，不同RSD處理對皂苷Rb1的降解率不同，這可能與不同碳氮比有機(jī)物料刺激產(chǎn)生的微生物類群對Rb1分解利用能力不同有關(guān)。

表1 定量PCR和PCR-DGGE所用的引物Table 1 Primers used in real-time PCR and PCR-DGGE

圖1 皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液及不同有機(jī)物料RSD處理土壤提取液HPLC圖。A: 皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液；B：CK；C：SB；D：BD；E：SB+BDFig. 1 HPLC profiles of standard saponins and soil extract from RSD treated soil relative to organic substrate. A: Standard saponinssolution; B: CK; C: SB；D: BD; E: SB+BD

表2 不同有機(jī)物料RSD處理對土壤中皂苷含量和降解率的影響Table 2 Effects of reductive soil disinfestation coupled with application of organic substrates on content and degradation rate of soil saponins relative to treatment

2.2 不同有機(jī)物料RSD處理對土壤微生物活性的影響

如圖2所示，與CK處理相比，RSD處理均能提高土壤微生物活性，其中BD處理的土壤微生物活性最高，達(dá)到39.7 μg·g-1·h-1干土，顯著高于CK處理（P≤0.05）。土壤強(qiáng)還原過程中添加的有機(jī)物料能夠?yàn)槲⑸锏纳L提供碳、氮源，從而能在一定程度上提高微生物活性，而BD處理中添加的有機(jī)物料氮含量最高，碳氮比最低，更適宜微生物的生長利用，這可能是BD處理土壤微生物活性最高的原因。

圖2 不同有機(jī)物料RSD處理對土壤微生物活性的影響Fig. 2 Effects of reductive soil disinfestation coupled with application of organic substrates on soil microbial activity relative to treatment

2.3 不同有機(jī)物料RSD處理對土壤微生物數(shù)量的影響

如圖3A和3B所示，不同有機(jī)物料RSD處理對土壤中細(xì)菌和真菌數(shù)量的影響不同，其中SB和SB+BD處理的細(xì)菌和真菌數(shù)量顯著低于CK和BD處理（P≤0.05），而CK和BD處理間無顯著差異。由圖3C和3D可知，與CK處理相比，RSD處理后，土壤中尖孢鐮刀菌的數(shù)量及其與真菌的比例均顯著下降（P≤0.05），但不同RSD處理間差異不顯著，其中所有RSD處理的殺菌率均高于99.7%。表明土壤強(qiáng)還原處理能夠有效殺滅土傳病原菌，降低其在土壤真菌類群中的占比，這可能與土壤強(qiáng)還原過程中產(chǎn)生的殺菌物質(zhì)如有機(jī)酸、還原性金屬離子有關(guān)；也可能與其創(chuàng)造的厭氧環(huán)境有關(guān)。

圖3 不同有機(jī)物料RSD處理對土壤中細(xì)菌（A）、真菌（B）、尖孢鐮刀菌（C）數(shù)量及尖孢鐮刀菌/真菌比（D）的影響Fig.3 Effects of reductive soil disinfestation coupled with application of organic substrates on bacteria (A), fungi (B), F. oxysporum(C), and F. oxysporum/fungi ratio (D) relative to treatment

2.4 不同有機(jī)物料RSD處理對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

如圖4所示，土壤強(qiáng)還原處理能夠顯著改變細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)（DGGE條帶的位置和數(shù)量）。聚類分析結(jié)果顯示土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分成2組，其中SB和CK處理聚在一起，BD和SB+BD處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)聚在一起（圖4A）；土壤真菌群落結(jié)構(gòu)同樣分成兩組，SB、BD和SB+BD處理的真菌群落結(jié)構(gòu)聚在一起，與CK處理分開，且SB和SB+BD處理的真菌群落結(jié)構(gòu)聚在一起，與BD處理分開（圖4B）。由表3可知，與CK處理相比，土壤強(qiáng)還原處理能夠顯著增加細(xì)菌的香農(nóng)多樣性和豐富度（P≤0.05），且SB+BD處理的多樣性和豐富度指數(shù)最高，分別為H'=3.46和S= 34.33，顯著高于SB和BD處理（P≤0.05）。此外，BD和SB+BD處理的真菌香農(nóng)多樣性和豐富度指數(shù)顯著高于CK處理和SB處理（P≤0.05），而處理間（BD與SB+BD；CK與SB）均無顯著差異（P＞0.05）。土壤強(qiáng)還原處理能夠顯著改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和提高其多樣性和豐富度（P≤0.05），且這些改變和提高與有機(jī)物料的碳氮比和多樣性有關(guān)。

圖4 不同處理土壤中細(xì)菌（A）和真菌（B）群落結(jié)構(gòu)的聚類分析Fig. 4 Cluster analysis of DGGE banding profiles for bacteria (A) and fungi (B) communities relative to type of organic substrate

表3 不同處理土壤中細(xì)菌和真菌香農(nóng)多樣性和豐富度指數(shù)Table 3 Shannon diversity and richness of bacteria and fungi in the soilrelative to treatment

2.5 不同有機(jī)物料RSD處理對三七生長的影響

如表4所示，與CK處理相比，土壤強(qiáng)還原處理對三七出苗率無顯著影響，但BD和SB+BD處理的出苗率差異顯著（P≤0.05）。移栽一年七籽條5個(gè)月后，土壤強(qiáng)還原處理的三七存苗率均顯著高于CK處理（P≤0.05），且BD處理的三七存苗率最高，達(dá)到66.7%；而CK處理的發(fā)病率最高，達(dá)到89.0%，顯著高于SB、BD和SB+BD處理（P≤0.05），且不同RSD處理間的三七發(fā)病率差異不顯著（P＞0.05）。隨著再植三七移栽時(shí)間的延長，三七的存苗率均逐漸降低，發(fā)病率則逐漸增加。至移栽8個(gè)月后，RSD處理的存苗率降低至35.1%～48.9%，但仍顯著高于CK處理（0%）；而RSD處理的發(fā)病率增加至36.6%～52.3%，是移栽5個(gè)月后發(fā)病率的2.75倍～4.67倍，仍顯著低于CK處理的100%。其中BD處理的存苗率最高，發(fā)病率最低?？梢娡寥缽?qiáng)還原處理能夠顯著增加三七的存苗率（P≤0.05），降低三七的發(fā)病率，但對三七的出苗率影響不大，這可能是因?yàn)槿咦褩l自身的質(zhì)量是影響出苗率最重要的因素。隨著移栽時(shí)間的延長，再植三七的存苗率逐漸下降，其原因可能是單一的土壤強(qiáng)還原處理對連作障礙因子的消除具有一定的局限性，未能將其消除完全，從而造成了再植三七發(fā)病率逐漸攀升的現(xiàn)象，這也從側(cè)面表明土壤中的障礙因子如病原菌數(shù)量和化感物質(zhì)含量是影響三七生長和發(fā)病最重要的因素。

表4 不同有機(jī)物料RSD處理對三七出苗率、存苗率及發(fā)病率的影響Table 4 Effects of reductive soil disinfestation coupled with organic substrates on germination rate, survival rate, and disease incidence of Sanqi seedlings relative to treatment

相關(guān)性分析（表5）顯示，土壤中皂苷Rb1、Rh1、Rb1+Rh1含量及F. oxysporum的數(shù)量與三七的存苗率呈顯著負(fù)相關(guān)（P≤0.01），與三七的發(fā)病率呈顯著正相關(guān)（P≤ 0.01），但與三七的出苗率無顯著相關(guān)性。而土壤中皂苷Rb1、Rb1+Rh1含量及F. oxysporum的數(shù)量與細(xì)菌多樣性和豐富度、真菌多樣性和豐富度呈顯著負(fù)相關(guān)（P≤ 0.05）；土壤中Rh1的含量僅與細(xì)菌多樣性和豐富度呈顯著負(fù)相關(guān)（P≤ 0.05）。表明RSD處理后，再植三七存苗率顯著增加、發(fā)病率顯著降低與連作土壤中障礙因子如病原菌和皂苷類化感物質(zhì)的顯著消除有關(guān)，而這些障礙因子的消除程度與RSD過程中土壤微生物的變化，如微生物多樣性和豐富度顯著增加有關(guān)。

表5 土壤中皂苷含量、病原菌數(shù)量與三七出苗率（移栽3個(gè)月）、存苗率和發(fā)病率（移栽5個(gè)月）、細(xì)菌多樣性和豐富度和真菌多樣性和豐富度的Pearson相關(guān)性分析Table 5 Pearson correlation coefficients of soil saponins content with F. oxysporum population, germination rate (3 months after transplantation), survival rate, disease incidence (5 months after transplantation), diversity and richness of bacteria and diversity and richness of fungi

3 討 論

三七是極其珍貴的中藥材，具有入藥歷史久，用藥范圍廣，市場需求量大等特征[1,6］。但是，三七是性喜溫暖陰濕的多年生免耕宿根植物，土傳病害問題較為嚴(yán)重，而且三七種植忌地性極強(qiáng)，存在嚴(yán)重的連作障礙問題[3］。近年來，隨著人們生活水平的提高，保健意識的加強(qiáng)，三七的社會需求量逐年遞增，但連年大面積單一的人工栽培模式導(dǎo)致三七的連作障礙問題日趨突出。并且隨著種植歷史的延長，可種植三七的土壤資源日益枯竭，道地三七的市場需求和生長能力之間形成了尖銳的矛盾[3］。目前，連作障礙已成為制約我國道地三七可持續(xù)生產(chǎn)的瓶頸。因此，解決三七忌連作問題，縮短土地資源再利用周期，保證三七栽培的可持續(xù)發(fā)展和三七藥材的道地性已經(jīng)刻不容緩。

土壤中化感自毒物質(zhì)累積及其效應(yīng)是再植三七產(chǎn)生連作障礙的主要因素，有效降低其在土壤中的濃度是緩解甚至克服三七連作障礙的重要前提[5-6］。利用活性碳、生物炭等具有吸附特性的吸附劑可有效降低土壤或營養(yǎng)液中化感自毒物質(zhì)的濃度，進(jìn)而減輕植物的化感自毒作用[1,27］。Yang等[15］的研究表明，在水培條件下，向溶液中添加活性炭能夠完全抵消三七根系分泌物中自毒物質(zhì)對三七存苗率的影響，其存苗率較只添加根系分泌物的處理高了3倍多，與只添加水的對照處理相似。但是，這種通過活性炭、生物炭等吸附劑降低土壤中化感物質(zhì)濃度的作用屬于物理作用，因此在一定的環(huán)境條件下，被活性炭或生物炭吸附的化感物質(zhì)會重新釋放回到土壤中，從而可能對再植作物的正常生長產(chǎn)生負(fù)面作用[28］。李勇等[29］研究發(fā)現(xiàn)，在平板條件下，向溶液中添加篩選得到的人參自毒物質(zhì)的降解微生物，能夠有效緩解自毒物質(zhì)對人參種子萌發(fā)的抑制作用。但是，在土壤條件下，其降解效果往往不穩(wěn)定，這是由于外源添加的微生物首先要適應(yīng)連作的土壤環(huán)境，并且還需與連作土壤土著微生物在養(yǎng)分和生態(tài)位的競爭中占優(yōu)，進(jìn)而才能在土壤中發(fā)揮其作用[30］。因此，生產(chǎn)上也未見有大面積推廣應(yīng)用的實(shí)例。在本研究中，經(jīng)過40d的土壤強(qiáng)還原處理，土壤中皂苷類化感自毒物質(zhì)的濃度顯著下降，其中Rb1和Rh1在BD和SB+BD處理中的降解率達(dá)到82%～88%，這是因?yàn)樵谕寥缽?qiáng)還原過程中，某些具有化感物質(zhì)降解能力的厭氧微生物被刺激產(chǎn)生并迅速增殖，從而促進(jìn)了皂苷類物質(zhì)的消除。其實(shí)，這種厭氧生物降解技術(shù)已經(jīng)在有機(jī)污染物尤其是氯代芳香族化合物的降解領(lǐng)域得到廣泛的研究和應(yīng)用[31］。但是，關(guān)于哪些微生物類群在土壤強(qiáng)還原過程中參與皂苷類物質(zhì)的降解，且如何通過改變有機(jī)物料的種類來調(diào)控這些微生物的數(shù)量、種類和活性仍值得進(jìn)一步的研究。

土壤微生物生態(tài)失衡，病原菌富集、有益菌減少是連作三七土傳病害頻發(fā)的主要原因[1］。降低土壤中病原菌的數(shù)量，改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是減少三七土傳病害發(fā)生率的關(guān)鍵。輪作非寄主植物是降低土傳病原菌數(shù)量，減少土傳病害發(fā)生率較為有效的農(nóng)業(yè)措施[6］。Zhao等[14］的研究發(fā)現(xiàn)，與連作三七土壤相比，短期的玉米輪作雖然能顯著降低病原菌在真菌中的占比，但并不能有效降低土壤中病原菌的數(shù)量，這可能是三七需要輪作10～30年才能再植的原因之一。土壤熏蒸劑如氯化苦等雖然能夠有效殺滅土壤病原微生物，但同時(shí)也降低了土壤中有益微生物的數(shù)量，還可能導(dǎo)致土壤微生物群體對病原微生物的競爭抑制作用下降[1］。此外，氯化苦、克百威等12種高毒農(nóng)藥將在5年內(nèi)全部禁用。本研究發(fā)現(xiàn)，高碳氮比有機(jī)物料、低碳氮比有機(jī)物料或高、低碳氮比混合物料的強(qiáng)還原處理均能顯著降低土壤中尖孢鐮刀菌的數(shù)量，殺菌率高達(dá)99.7%，這是因?yàn)樵谕寥缽?qiáng)還原過程中，厚壁菌門厭氧微生物如梭菌科（Clostridiaceae）等能夠在分解有機(jī)物料的同時(shí)，產(chǎn)生一些具有殺菌作用的小分子有機(jī)酸如乙酸、丁酸等，同時(shí)這些微生物類群還能分泌抗真菌物質(zhì)，從而對病原菌起到殺滅作用[32-33］。Momma等[34］以強(qiáng)還原過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸種類和濃度為依據(jù)，通過平板添加試驗(yàn)的研究表明有機(jī)酸能夠有效殺滅病原菌的繁殖體，抑制孢子的萌發(fā)，這與本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果一致[33］。此外，尖孢鐮刀菌在真菌中的占比也顯著下降，其下降的幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過短期玉米輪作，表明土壤強(qiáng)還原處理能夠選擇性地殺滅土傳病原菌，同時(shí)還能刺激其他真菌類群的生長增殖，從而在一定程度上加劇了其他真菌與病原菌在生態(tài)位及養(yǎng)分的競爭，潛在地增強(qiáng)了土壤微生物的抑病能力[14］。低碳氮比有機(jī)物料和高、低碳氮比混合物料強(qiáng)還原處理中病原菌/真菌比例低于高碳氮比有機(jī)物料強(qiáng)還原處理，其原因可能是低碳氮比有機(jī)物料較易分解，能利用的微生物類群譜更廣，因此能刺激產(chǎn)生更多的真菌類群和更大的種群數(shù)量。

連作土壤中化感物質(zhì)降解率和殺菌率是衡量三七連作障礙因子消除與否和消除程度的關(guān)鍵，而三七再植之后的存苗率、發(fā)病率才是衡量土壤強(qiáng)還原處理方法能否有效緩解三七連作障礙的重要指征。本研究發(fā)現(xiàn)，移栽一年七籽條5個(gè)月后，連作土壤中三七的存苗率僅7.8%，發(fā)病率高達(dá)89.0%；而RSD處理的存苗率為57.1%～66.7%，發(fā)病率僅為12.9%～16.1%，這表明土壤強(qiáng)還原處理能有效緩解三七的連作障礙，且存苗率與土壤中皂苷物質(zhì)含量和病原菌數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)強(qiáng)還原處理是一種具有有效消除連作障礙因子潛力的土壤處理方法。但是，再植三七的存苗率隨再植時(shí)間的延長而逐漸下降，發(fā)病率則逐漸增加。在移栽一年七籽條八個(gè)月以后，RSD處理的存苗率為35.1%～48.9%，雖仍顯著高于對照處理，但也明顯低于同期未種植過三七的新土，這可能是由于單一的土壤強(qiáng)還原處理未能將三七種植過后的土壤條件完全恢復(fù)到種植以前的水平。因此，繼續(xù)研究如何提高RSD處理對連作障礙因子清除的效果，開發(fā)相應(yīng)的農(nóng)業(yè)措施，延緩三七在連續(xù)種植過程中的發(fā)病速度顯得尤為必要。

土壤強(qiáng)還原處理是一種操作簡單、處理時(shí)間短、不耽誤農(nóng)時(shí)的作物種植前的土壤處理方法[12］。雖然強(qiáng)還原措施自身具有一定的復(fù)雜性，但我們前期大量的田間試驗(yàn)表明，只要嚴(yán)格控制條件，其效果是有效且穩(wěn)定的，不因土壤類型、作物種類的變化而明顯變化[13,26,33,35］。此外，強(qiáng)還原措施所需的成本主要受處理過程中所用物料的種類、收集所需成本的影響而波動，但對于具有高價(jià)值的蔬菜、瓜果、花卉等作物，其處理成本與連作后的搬遷成本、繼續(xù)連作可能導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失以及連作過程中防控病害所需農(nóng)藥的花費(fèi)相比，并不算高，因而可以被廣大種植戶所接受。目前，我們在云南省和浙江省進(jìn)行了大面積的示范推廣，反響良好。

4 結(jié) 論

土壤強(qiáng)還原處理是一種快速有效消除土壤連作障礙因子的方法，能夠顯著降低連作三七土壤中皂苷類化感自毒物質(zhì)的含量，有效殺滅富集的土傳病原微生物，還能夠增加土壤微生物多樣性和活性，提高連作三七的存苗率、降低其發(fā)病率。因此，土壤強(qiáng)還原處理是一種具有解決三七忌連作問題，縮短土壤資源再利用周期潛力的農(nóng)業(yè)措施，但離農(nóng)業(yè)實(shí)際生產(chǎn)還有一定的距離，仍需進(jìn)一步的科學(xué)研究。