李早霞，衣文索，顏?zhàn)R涵，王化斌

（1.長春理工大學(xué) 光電工程學(xué)院，長春 130022；2.中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院，重慶 400714）

脫氧核糖核酸（DNA）是由兩條鏈（由核苷酸組成）組成的分子，它們彼此纏繞以形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，攜帶著生物生長、發(fā)育和繁殖的遺傳指令。目前生物體內(nèi)與藥物作用的三種主要靶向分子分別為酶、受體及核酸，其中以酶和受體為靶的藥物設(shè)計開始較早，而以核酸為靶的藥物研究則起步較晚［1］。研究DNA與藥物小分子之間的相互作用將有助于理解某些藥物分子對DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄的影響［2］；有助于闡明一些致癌物質(zhì)或者一些抗腫瘤、抗病毒藥物的作用機(jī)制，幫助人們了解某些疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物的治病機(jī)理；有助于發(fā)現(xiàn)和篩選新型小分子藥物。

目前，已經(jīng)有許多技術(shù)用于研究小分子與DNA之間的相互作用，如光譜方法、電泳和電化學(xué)方法、核磁共振技術(shù)和微量熱法等［3］。其中光譜方法如熒光光譜、紅外光譜、拉曼光譜等作為物理方法，具有良好的應(yīng)用前景。這些技術(shù)的開發(fā)和發(fā)展促進(jìn)了新藥的發(fā)現(xiàn)，并在臨床治療的研究和應(yīng)用方面取得了很大進(jìn)展。但熒光光譜需要標(biāo)記分子，可能會導(dǎo)致觀察到的現(xiàn)象中包含非目標(biāo)分子信息［4］；而紅外光譜主要反應(yīng)官能團(tuán)的信息，對分子整體構(gòu)象變化不敏感，不適用于非共價鍵結(jié)合模式；拉曼光譜由于需要激光激發(fā)，極易導(dǎo)致被測樣品的損壞，影響測試的準(zhǔn)確性［5］。因此，不斷研究新型檢測技術(shù)是發(fā)展藥物開發(fā)的必要手段。開發(fā)快速、靈敏的技術(shù)來研究DNA和藥物之間的相互作用，可以為進(jìn)一步加快藥物開發(fā)的過程提供技術(shù)支持。

基于飛秒脈沖激光的太赫茲時域光譜檢測技術(shù)能夠做到對待測對象高靈敏、無損傷的檢測。太赫茲波通常是指頻率范圍在0.1THz～10THz內(nèi)的電磁波，其在電磁波波譜中介于微波和紅外輻射之間，處于由電子學(xué)向光子學(xué)過渡的區(qū)域。很多生物大分子的振動和轉(zhuǎn)動能級以及晶體中晶格的振動吸收均對應(yīng)于太赫茲波段。藥物小分子與DNA相互作用的主要作用模式之一是非共價鍵結(jié)合，太赫茲光譜能夠表征非共價鍵作用，包括分子內(nèi)和分子間的振動和轉(zhuǎn)動能級、氫鍵和范德華力［6］，所以太赫茲光譜在檢測小分子藥物方面具有很大潛力。在被測對象的不同狀態(tài)和反應(yīng)過程中，通過分析太赫茲波段內(nèi)獨(dú)特指紋特征的變化，可以研究化學(xué)和生物分子、化合物的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)動力學(xué)信息。

亞甲基藍(lán)（MB）已被證明通過非共價鍵作用與DNA發(fā)生強(qiáng)烈相互作用［7］。MB首先由Heinrich Caro于1876年制備，它是一種化學(xué)式為C16H18N3SCl的雜環(huán)芳香族化合物，已被廣泛用于生物和化學(xué)領(lǐng)域［8］。實(shí)驗(yàn)以亞甲基藍(lán)為例，測試了其單組分及與雙鏈DNA（來源于玉米基因組DNA）及單鏈DNA（來源于鮭魚精）物理混合和溶解結(jié)晶的太赫茲光譜。當(dāng)MB與雙螺旋DNA以溶解結(jié)晶的方式結(jié)合后，水合MB的特征吸收峰消失；而簡單的物理混合則不會造成這一現(xiàn)象。MB水合物光譜中太赫茲特征吸收峰的保留或消失表明了物理或化學(xué)變化的差異。以此可以確定藥物小分子與DNA是否發(fā)生了相互作用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品制備

亞甲基藍(lán)水合物（CAS號7220-79-3）和單鏈DNA（CAS號438545-06-3）購自Aladdin（中國上海）。實(shí)驗(yàn)中其它所用溶劑均購自SCR（中國上海）。快速DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。亞甲基藍(lán)水合物及無水合物參照報道的重結(jié)晶方法制備［8］。雙鏈DNA來源于參照標(biāo)準(zhǔn)方案從玉米葉組織中純化的基因組DNA。物理混合物的獲得是通過使用渦旋混合器在玻璃小瓶中以質(zhì)量比為1∶1的比例輕輕混合。溶解結(jié)晶是通過在不同材料比例的H2O水溶液中37℃重結(jié)晶，隨后在室溫和高濕環(huán)境下暴露24小時以上。然后使用手動壓片機(jī)壓制直徑為15.0mm，厚度為約1.0mm的樣品進(jìn)行測量。

1.2 太赫茲光譜儀

太赫茲時域光譜技術(shù)（Terahertz time-domain spectroscope，THz-TDS）是利用太赫茲脈沖在樣品表面發(fā)生反射或透射過樣品后所產(chǎn)生的太赫茲時域信號，然后經(jīng)過傅里葉變換獲得頻域上的振幅及相位的變化［9］。

實(shí)驗(yàn)使用Picometrix T-ray 5000光纖耦合光譜儀（Advanced Photonix，Inc.，MI，USA）以透射模式進(jìn)行太赫茲光譜測量。光譜儀使用飛秒激光脈沖和LT-InGaAs光電導(dǎo)天線來生成相干探測時域系統(tǒng)中超短太赫茲脈沖電場。T-ray 5000裝置原理圖如圖1所示，飛秒脈沖激光器發(fā)出的激光（中心波長1064nm，重復(fù)頻率100MHz）經(jīng)過激光分束鏡分為兩路，一路為泵浦激光，另一路為探測激光。泵浦激光激發(fā)光電導(dǎo)發(fā)射天線輻射出太赫茲波，然后太赫茲波經(jīng)左右對稱的一對高阻硅透鏡后照射到光電導(dǎo)探測天線。在此過程中，通過光學(xué)延遲線改變探測激光和泵浦激光之間的光程差實(shí)現(xiàn)時域等效采樣而得到完整的太赫茲時域信號［10］。對太赫茲時域波形進(jìn)行傅里葉變換可以得到該電磁脈沖在頻率域的分布。

太赫茲光譜測量環(huán)境均在溫度21.0±0.4℃，相對濕度＜2.0%條件下進(jìn)行。

圖1 T-ray 5000裝置原理圖

2 結(jié)果與討論

2.1 亞甲基藍(lán)的太赫茲光譜特征

水合是水分子在物質(zhì)中存在的一種重要形式，分子的水合常常會引起其物質(zhì)性質(zhì)的變化。五水MB及無水MB在0.2～2.0THz的太赫茲吸收光譜顯示如圖2所示，MB五水合物的太赫茲吸收光譜在位于0.85THz和1.62THz有明顯的特征吸收峰；而無水MB在測量光譜范圍內(nèi)則沒有發(fā)現(xiàn)特征吸收峰。

圖2 亞甲基藍(lán)的太赫茲光譜特征

結(jié)果表明MB五水合物和MB無水合物的太赫茲吸收特征與MB分子的結(jié)晶狀態(tài)及相互作用有關(guān)。在咖啡因的太赫茲光譜中也觀察到由結(jié)晶水變化及分子相互作用改變引起的太赫茲吸收光譜的差異［11］。

2.2 亞甲基藍(lán)與DNA不同結(jié)合方式下的太赫茲吸收光譜

小分子藥物與DNA的特異性結(jié)合，在基因表達(dá)的調(diào)控過程及很多抗癌藥物的體內(nèi)作用方式的研究中非常重要［1］。為了獲得小分子藥物MB與DNA不同結(jié)合方式下的太赫茲吸收光譜，實(shí)驗(yàn)又分別測試了五水MB和DNA在溶解結(jié)晶和物理混合狀態(tài)下的太赫茲光譜，結(jié)果如圖3所示。溶解結(jié)晶的太赫茲吸收光譜失去了0.85THz和1.62THz頻率下的特征吸收峰，而在物理混合物和單個組分中均存在這兩處頻率下的吸收峰。因?yàn)槲锢砘旌虾驧B與DNA分子間作用的距離還不足以達(dá)到產(chǎn)生非共價鍵結(jié)合，所以保留了各自的特征吸收峰；而溶解能幫助分子間產(chǎn)生非共價鍵結(jié)合，使得表征MB原構(gòu)象特征的特征吸收峰消失。MB水合物光譜中太赫茲特征吸收峰的保留或消失表明了物理或化學(xué)變化的差異。以此可以確定藥物小分子與DNA是否發(fā)生了相互作用。

有研究表明，單鏈DNA在分子力學(xué)性質(zhì)、吸收光譜、堿基反應(yīng)性質(zhì)等方面都和雙鏈DNA不同［12］。實(shí)驗(yàn)又分別對五水MB和單、雙鏈DNA進(jìn)行了太赫茲光譜檢測。圖3（a）表明檢測MB水合物與單鏈DNA無論物理混合或是溶解后再結(jié)晶，其產(chǎn)物的太赫茲吸收光譜中都包含兩個特征吸收峰；圖3（b）表明檢測MB水合物與雙鏈DNA的物理混合物時，這些太赫茲光譜特征仍然存在。而檢測MB水合物與雙鏈DNA結(jié)合形成的溶解結(jié)晶時，MB水合物太赫茲吸收光譜中的吸收峰消失。物理混合后由于各組分間空間距離不足以引發(fā)物質(zhì)間相互作用，混合物的光譜特征源于各組分各自信息的疊加［13］，MB與DNA物理混合同MB水合物的太赫茲特征吸收峰位置基本相同；而溶解可提供各組分發(fā)生相互作用的條件，但MB與單鏈DNA溶解結(jié)晶后依然具有同MB水合物相同位置的太赫茲特征吸收峰，說明這個體系內(nèi)的MB水合物未發(fā)生構(gòu)象變化，而與雙鏈DNA溶解結(jié)晶后特征吸收峰消失說明MB同雙鏈DNA發(fā)生了反應(yīng)。溶液中，MB與雙鏈DNA發(fā)生非共價鍵結(jié)合［14］。MB與雙鏈DNA兩者的相互作用會引發(fā)MB水合物構(gòu)象的變化，使其失去了原本的太赫茲特征吸收峰。

圖3 MB水合物與DNA相互作用的太赫茲吸收光譜

眾所周知，共結(jié)晶是由于兩種或多種不同組分分子之間的分子間氫鍵、非離子鍵或其他非共價鍵相互作用而產(chǎn)生的。MB可以與雙鏈DNA相結(jié)合，該結(jié)果意味著形成的共結(jié)晶改變了MB的組成和分子間或分子內(nèi)的相互作用，這與單親組分的晶格顯著不同。因此，在這些光譜中觀察到的特征吸收峰的消失是由于分子間非共價鍵結(jié)合使得MB水合物失去了原有的光譜特征。

2.3 亞甲基藍(lán)與DNA不同濃度結(jié)合的太赫茲吸收光譜

太赫茲吸收光譜特征吸收峰振幅的高低可以反應(yīng)對應(yīng)物質(zhì)的量的多少，圖4是DNA與MB在1∶1、2∶1、4∶1這三種濃度比例下，對溶解后的析出物的檢測結(jié)果。

圖4 DNA與MB不同濃度比例的結(jié)合

圖4（a）中是單鏈DNA與MB不同濃度比例的混合。由圖中可以看出，單鏈DNA與MB以1∶1濃度混合時，太赫茲特征吸收峰的峰值最大，隨著DNA與MB濃度比例的增大，相應(yīng)的特征吸收峰的相對高度明顯降低。MB與單鏈DNA混合降低了檢測物中MB的相對含量，使得特征吸收峰降低。圖4（b）是雙鏈DNA與MB不同濃度比例的結(jié)合，由圖3已經(jīng)知道，MB水合物與雙螺旋DNA結(jié)合會使其失去特征吸收峰。MB水合物與雙螺旋DNA濃度比例在4∶1、2∶1的時候沒有特征吸收峰，可以判斷MB已反應(yīng)完全；濃度比例的結(jié)合是1∶1的時候還存在一個小的吸收峰，是由于還有部分MB水合物沒有結(jié)合完，所以留存了部分痕跡。說明這種雙鏈DNA與MB反應(yīng)完全的濃度比例在1∶1和2∶1之間。

3 結(jié)論

通過采用太赫茲吸收光譜法檢測亞甲基藍(lán)（MB）與雙螺旋DNA之間的相互作用，提供了利用太赫茲光譜檢測小分子藥物的實(shí)例。MB水合物與單鏈DNA溶解結(jié)晶后由于未發(fā)生相互作用反應(yīng)，沒有導(dǎo)致MB構(gòu)象的變化；伴隨著與雙鏈DNA溶解結(jié)晶后造成的MB構(gòu)象的變化，MB水合物的太赫茲光譜特征峰消失。說明可以通過監(jiān)測反應(yīng)物與產(chǎn)物太赫茲吸收光譜的變化判斷小分子藥物與DNA是否發(fā)生了相互作用，為篩選小分子藥物提供了一種無標(biāo)記檢測新方法。