李秋亞，孫 婷，王東凱

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銀杏內(nèi)酯B多晶型的制備、表征與性質(zhì)研究

李秋亞1,2，孫 婷2，王東凱1*

（1. 沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2. 沈陽沃森藥物研究所，遼寧 沈陽 110016）

研究銀杏內(nèi)酯B多晶型的制備、表征與性質(zhì)。對(duì)銀杏內(nèi)酯B進(jìn)行多晶型篩查，并制備了6種不同的晶型（A～F型），分別采用單晶X射線衍射法（SXRD）、差示掃描量熱法（DSC）、熱重分析法（TG）對(duì)樣品進(jìn)行表征分析，并進(jìn)一步研究銀杏內(nèi)酯B不同晶型對(duì)谷氨酸導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷保護(hù)作用的優(yōu)劣。各晶型PXRD、DSC、TG圖譜均存在明顯的差異，可用上述方法進(jìn)行鑒別。無溶劑晶型F型為穩(wěn)定晶型，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明了晶型F對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用更強(qiáng)。銀杏內(nèi)酯B晶型F為優(yōu)勢(shì)用藥晶型。

藥劑學(xué)；多晶型；晶型制備；表征分析；銀杏內(nèi)酯B

藥物的分子排列結(jié)構(gòu)不同產(chǎn)生的兩種或兩種以上晶格的結(jié)構(gòu)，形成了多種晶型的現(xiàn)象，這種藥物通常稱之為多晶型藥物。由于結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的理化性質(zhì)的差異，不同的晶型在外觀、顏色、硬度、密度、溶解度、熔點(diǎn)以及溶出率等方面存在顯著的差異，以此導(dǎo)致了藥物在安全性、穩(wěn)定性以及療效方面的不同[1-4]。

銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B）來源于銀杏葉，分子式為C20H24O10，原料是白色結(jié)晶性粉末。銀杏內(nèi)酯B屬銀杏二萜內(nèi)酯類化合物，有抗血小板聚集[5]、對(duì)缺血損傷的保護(hù)[6-7]、抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗炎[8-9]等藥理作用，主要用于缺血性心腦血管疾病的治療。

銀杏內(nèi)酯B存在多晶型現(xiàn)象，作者通過溶劑去除法、溫度轉(zhuǎn)晶法等共發(fā)現(xiàn)6種晶型物質(zhì)。采用粉末X射線衍射法（PXRD）、差示掃描量熱法（DSC）和熱重分析法（TG）等不同晶型分析技術(shù)對(duì)獲得的晶型物質(zhì)進(jìn)行表征分析研究，并通過研究銀杏內(nèi)酯B不同晶型對(duì)谷氨酸導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，比較銀杏內(nèi)酯B不同晶型的藥理作用，以明確銀杏內(nèi)酯B的優(yōu)勢(shì)藥用晶型。

1 儀器與材料

D8 AdvanceX射線衍射儀、SMART APEX-Ⅱ單晶X射線衍射儀(德國(guó)Bruker-AXS公司)，TGA 8000熱重分析儀（美國(guó)PerkinElmer公司），SmarVapor RE-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)SmarVapor公司），VAC真空干燥箱、HH電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（廣東宏展科技有限公司）,1000TH藥品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)箱（北京蘭貝石恒溫技術(shù)很有限公司），UPH-IV超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

谷氨酸、DMSO、MTT（美國(guó)Sigma公司），LDH試劑盒（南京建成生物公司），F(xiàn)ura-2 /AM、RIPA裂解液、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（碧云天生物公司），高分化PC12細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞所）。

2 方法與結(jié)果

2.1 銀杏內(nèi)酯B多晶型的制備

2.1.1 晶型A的制備

稱取樣品50 mg，在50 ℃的條件下溶于1 mL乙腈中，向溶液中緩慢滴加1 mL水，冷卻至室溫析晶，靜置1 d后抽濾，濾餅于40 ℃真空干燥4 h，獲得晶型A樣品。

2.1.2 晶型B的制備

稱取樣品50 mg加至2 mL甲醇中，置于40 ℃水浴中加熱待樣品完全溶解后，使用旋蒸儀快速去除溶劑，設(shè)定溫度35 ℃、氣壓90 kPa、轉(zhuǎn)速90 r?h-1，所得固體物質(zhì)即晶型B樣品。

2.1.3 晶型C的制備

稱取樣品50 mg加至4 mL二氧六環(huán)中，置于40 ℃水浴中加熱待樣品完全溶解后，使用旋蒸儀快速去除溶劑，設(shè)定氣壓90 kPa 、轉(zhuǎn)速90 r?h-1、溫度35 ℃，所得固體物質(zhì)即晶型C樣品。

2.1.4 晶型D的制備

稱取樣品50 mg加至3 mL DMSO中，置于40 ℃水浴中加熱完全溶解后，緩慢加入1 mL水，冷卻至室溫析晶，靜置2 d后抽濾，濾餅于40 ℃真空干燥4 h，獲得晶型D樣品。

2.1.5 晶型E的制備

稱取樣品50 mg加至2 mL吡啶中，置于40 ℃水浴中加熱完全溶解后，緩慢加入1 mL水，冷卻至室溫析晶，靜置1 d后抽濾，濾餅于40 ℃真空干燥4 h，獲得晶型E樣品。由于晶型E樣品不穩(wěn)定，所以后面的研究未對(duì)該晶型進(jìn)行測(cè)定。

2.1.6 晶型F的制備

稱取樣品100mg，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，設(shè)定溫度為200℃，靜置30 min，獲得晶型F樣品。

2.2 五種晶型樣品的物質(zhì)狀態(tài)表征

采用PXRD、DSC、TG等不同原理的分析方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)中獲得的銀杏內(nèi)酯B 5種不同的晶型進(jìn)行表征分析，結(jié)果4種晶型樣品為含有結(jié)晶溶劑物質(zhì)，只有1種為無結(jié)晶溶劑物質(zhì)。

2.2.1 PXRD法表征

取上述制得的晶型A～D和F共5種樣品，分別稱量50 mg，使用粉末X射線衍射儀測(cè)定。使用的X射線發(fā)生器：CuKa，40 kV，150 mA。掃描范圍2= 3°～80°，掃描速度8°?min-1，掃描步長(zhǎng)為0.02°，接收狹縫RS = 0.15 mm。5種樣品的PXRD測(cè)定結(jié)果見圖1。

結(jié)果表明，各晶型的粉末X射線衍射圖譜（2范圍3°～80°）中衍射峰的位置、數(shù)量、強(qiáng)度等均存在明顯的差異，因此可以利用PXRD法對(duì)實(shí)驗(yàn)中不同晶型樣品進(jìn)行鑒別。其中，銀杏內(nèi)酯B晶型A與原料藥一致，銀杏內(nèi)酯B晶型B～D樣品為晶態(tài)物質(zhì)。

2.2.2 DSC法表征

稱取銀杏內(nèi)酯B晶型A～D、F樣品各3 mg放于鋁制坩堝中，使用差示掃描量熱儀進(jìn)行DSC法測(cè)定，初始溫度30 ℃，升溫速率10 ℃?min-1，溫度上限500 ℃，測(cè)定結(jié)果見表1。

Table 1 DCS results of five crystal forms of ginkgolid B

結(jié)果表明，銀杏內(nèi)酯B各晶型的DSC圖譜有明顯差異，吸熱峰、放熱峰位置均不相同，因此可以使用DSC法進(jìn)行鑒別。銀杏內(nèi)酯B四種晶型A～D在高溫條件下發(fā)生轉(zhuǎn)晶，向晶型F轉(zhuǎn)變。晶型F在高溫狀態(tài)下無變化。

2.2.3 TG法表征

分別精確稱量晶型A 6.75 mg、晶型B 7.98 mg、晶型C 7.44 mg、晶型D 9.35 mg和晶型F 8.12 mg，放置于鋁制坩堝中，使用熱重分析儀進(jìn)行TG法測(cè)定銀杏內(nèi)酯B五種晶型樣品含有結(jié)晶溶劑量。儀器設(shè)定初始溫度30 ℃，升溫速率10 ℃?min-1，溫度上限500 ℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2與圖2。

Table 2 TG results of five solid phases of ginkgolide B

Note：——It means there is no solvent

從圖2中可以看出，銀杏內(nèi)酯B晶型A～D均有明顯的失重臺(tái)階，且存在差異。通過計(jì)算確定銀杏內(nèi)酯B 5種晶型的結(jié)晶溶劑含量，晶型A含有1.1個(gè)水，晶型B含有0.9個(gè)甲醇，晶型C含有0.8個(gè)二氧六環(huán)，晶型D含有0.9個(gè)DMSO。也證明了銀杏內(nèi)酯B晶型F為無溶劑合物。在一定條件下，各晶型均向晶F型轉(zhuǎn)變。

2.3 銀杏內(nèi)酯B晶型A和F對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

因?yàn)榫虵不含有機(jī)溶劑且穩(wěn)定性較好，為確定晶型F是否為優(yōu)勢(shì)藥用晶型，對(duì)比晶型F與原料藥（晶型A）的差異，設(shè)計(jì)了不同的藥理實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 銀杏內(nèi)酯B對(duì)谷氨酸處理PC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105mL-1，接種至24孔板中，并按照預(yù)設(shè)谷氨酸以及藥物濃度進(jìn)行處理。處理結(jié)束后每孔加入終濃度為1 μmol?L-1的Fura-2/AM探針并重新放于培養(yǎng)箱中孵育15 min，PBS溶液沖洗2次，置多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為355 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為538 nm。按試劑盒說明檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。

2.3.2 銀杏內(nèi)酯B對(duì)谷氨酸處理PC12細(xì)胞LDH釋放量的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105mL-1，接種至24孔板中，并按照預(yù)設(shè)谷氨酸以及藥物濃度進(jìn)行處理。處理結(jié)束后收集各組細(xì)胞上清液100 μL，按試劑盒說明測(cè)定LDH活性?？瞻讓?duì)照孔的PC12細(xì)胞經(jīng)裂解后釋放出全部的LDH，作為L(zhǎng)DH的參比總濃度同時(shí)計(jì)算其他各組的LDH濃度，分別除以LDH總濃度，進(jìn)而計(jì)算得到各組釋放LDH的百分比。

2.3.3 銀杏內(nèi)酯B對(duì)谷氨酸處理PC12細(xì)胞MDA水平的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105mL-1，接種至24孔板中，并按照預(yù)設(shè)谷氨酸以及藥物濃度進(jìn)行處理，PBS溶液沖洗2次，加入裂解液裂解細(xì)胞，隨后取上清液分別于532 nm測(cè)定吸光度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

A—The effects of ginkgoide B on influencing the concentration of intracellular Ca2+ of glutamate-treated PC12 cells. B—The effects of ginkgoide B on influencing the LDH release of glutamate-treated PC12 cells. C—The effects of ginkgoide B on influencing the intracellular MDA levels of glutamate-treated PC12 cells. Results were presented as mean ± S.E.M. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA with Tukey's HSD test. ***P< 0.001 vs. the control group. ###P < 0.001, ##P < 0.01 vs. the Glu group. ### $P< 0.05 vs. the Glu + GB-A group

結(jié)果表明：銀杏內(nèi)酯B原藥與晶型F均能顯著降低谷氨酸導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，且銀杏內(nèi)酯B晶型F的抑制作用更加明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；銀杏內(nèi)酯B原藥與晶型F均能夠顯著抑制谷氨酸導(dǎo)致的PC12細(xì)胞LDH的釋放，但原藥與晶型F相比無顯著性差異；銀杏內(nèi)酯B原藥與晶型F均能顯著降低谷氨酸導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)MDA水平的升高，且銀杏內(nèi)酯B晶型F的抑制作用更加明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合以上結(jié)果，銀杏內(nèi)酯B晶型F在保護(hù)PC12細(xì)胞的藥理作用上優(yōu)于銀杏內(nèi)酯B晶型A。

3 結(jié)論與討論

作者通過多種晶型篩查技術(shù)確定了銀杏內(nèi)酯B不同晶型的制備條件。分別采用單晶X射線衍射法（SXRD）、粉末X射線衍射法（PXRD）、差示掃描量熱法（DSC）和熱重分析法（TG）對(duì)各晶型樣品進(jìn)行表征分析，各個(gè)晶型的物理化學(xué)性質(zhì)差異較大，易于區(qū)分。并研究銀杏內(nèi)酯B晶型A和F對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，使用鈣超載、細(xì)胞膜通透性以及氧化應(yīng)激等分子機(jī)制比較銀杏內(nèi)酯B晶型A和F的藥理作用，初步確定晶型F為優(yōu)勢(shì)藥用晶型。接下來的研究將主要集中在不同劑型中銀杏內(nèi)酯B晶型F作為優(yōu)勢(shì)藥用晶型與原型藥作用的差異。

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Polymorphism preparation and characterization of ginkgolide B

LI Qiuya1,2, SUN Ting2, WANG Dongkai1*

(1.,,110016,; 2.,110016,)

To explore the preparation, characterization and properties of ginkgolide B-related polymorphs.By the methods of single crystal X-ray diffraction (SXRD), powder X-ray diffraction (PXRD), differential scanning calorimetry (DSC) as well as thermogravimetric analysis (TG), six kinds of crystal structure of ginkgolide B (form A-F) were prepared. To confirm the dominant crystal form of ginkgoide B, the protective effects of different crystal structures of ginkgolide B were further detected on glutamate-treated PC12 cells.The results indicated that there were significant differences among the crystal structures of ginkgolide B by using PXRD, DSC and TG. Furthermore, we observed that the form F was the most stable crystal form and showed better neural protective effects compared with the original form.The form F is the dominant crystal form of ginkgoide B.

pharmaceutics; polymorphs; polymorphs preparation; polymorphs characterizations; ginkgolide B

2019-04-01

李秋亞(1990-), 男(漢族), 遼寧沈陽人, 碩士研究生, E-mail 460345214@qq.com;

王東凱(1962-), 男(漢族), 遼寧沈陽人, 教授, 博士, 博士生導(dǎo)師, 主要從事藥物新技術(shù)與新劑型的研究, Tel. 024-43520528, E-mail wangdksy@ 163. com。

R94

A

（2019）04–0100–07

10.14146/j.cnki.cjp.2019.04.002

(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)