王景欣，仇俊新，丁平田

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阿莫西林克拉維酸鉀片仿制制劑與參比制劑雜質(zhì)譜對(duì)比分析

王景欣1,2，仇俊新2，丁平田1

（1. 沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2. 華北制藥股份有限公司，河北 石家莊 050010）

評(píng)價(jià)阿莫西林克拉維酸鉀片仿制制劑與參比制劑雜質(zhì)譜的一致性。方法通過對(duì)比分析《中華人民共和國藥典》2015年版、《美國藥典》41版、《英國藥典》2018版收載的阿莫西林克拉維酸鉀片有關(guān)物質(zhì)的檢測方法以及雜質(zhì)限值，確定本品有關(guān)物質(zhì)色譜條件并進(jìn)行分析方法驗(yàn)證、優(yōu)化雜質(zhì)含量計(jì)算方法，對(duì)比分析仿制制劑與參比制劑雜質(zhì)譜的一致性。結(jié)果本阿莫西林克拉維酸鉀片有關(guān)物質(zhì)檢測方法專屬性強(qiáng)、線性、耐用性等良好；優(yōu)化后雜質(zhì)含量計(jì)算方法更能真實(shí)地反映藥品質(zhì)量。結(jié)論本方法能夠有效控制阿莫西林克拉維酸鉀片的有關(guān)物質(zhì)；仿制制劑與參比制劑雜質(zhì)譜一致。

藥劑學(xué)；阿莫西林克拉維酸鉀片；高效液相色譜法；阿莫西林；克拉維酸；有關(guān)物質(zhì)；雜質(zhì)譜

阿莫西林克拉維酸鉀片是國家基本藥物，其中阿莫西林是-內(nèi)酰胺類廣譜抗生素，克拉維酸是一種不可逆型-內(nèi)酰胺酶抑制劑，能夠滅活-內(nèi)酰胺酶，減少阿莫西林被-內(nèi)酰胺酶的水解程度，增強(qiáng)阿莫西林對(duì)細(xì)菌的抑制作用，降低耐藥性的發(fā)生[1-2]。2016年3月5日，國務(wù)院印發(fā)《關(guān)于開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)的意見》[3]，表明推進(jìn)仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)的工作已提至國家戰(zhàn)略高度。2016年5月25日，總局發(fā)布“關(guān)于落實(shí)《國務(wù)院辦公廳關(guān)于開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)的意見》有關(guān)事項(xiàng)的公告”[4]明確規(guī)定到2018年底需要完成基藥品種“阿莫西林克拉維酸鉀片”質(zhì)量和療效的一致性評(píng)價(jià)工作。

當(dāng)前仿制藥一致性評(píng)價(jià)中，如何對(duì)仿制藥的關(guān)鍵質(zhì)量屬性—有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，成為藥學(xué)評(píng)價(jià)的關(guān)鍵。本課題組在對(duì)比分析國內(nèi)外相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，確定本品有關(guān)物質(zhì)色譜條件，參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]優(yōu)化雜質(zhì)含量計(jì)算方法，因?yàn)楸酒肺礄z測出來源于克拉維酸的雜質(zhì)，因此，將來源于阿莫西林的特定雜質(zhì)，用阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)品，外標(biāo)法計(jì)算樣品中雜質(zhì)含量，能更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卦u(píng)價(jià)仿制制劑與參比制劑雜質(zhì)譜的一致性。

1 儀器與材料

安捷倫Agilent1200高效液相色譜儀、Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（安捷倫科技有限公司），BP211D電子天平（德國塞多利斯集團(tuán)）。

阿莫西林對(duì)照品（含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.8%，批號(hào)130409-201011）、克拉維酸對(duì)照品（含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%，批號(hào)130429-201307）、阿莫西林克拉維酸鉀系統(tǒng)適用性對(duì)照品（批號(hào)130588- 201202）（中國食品藥品檢定研究院），阿莫西林克拉維酸鉀片（自研，批號(hào)170201、170202、170203），阿莫西林克拉維酸鉀片參比制劑（GSK，批號(hào)759181、794359、832706）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的選擇

《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）、《美國藥典》41版（USP41）、《英國藥典》2018版（BP2018）均收載了阿莫西林克拉維酸鉀片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。USP41版未對(duì)本品的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢查和控制，對(duì)ChP2015年版和BP2018版阿莫西林克拉維酸鉀片的有關(guān)物質(zhì)檢查方法的色譜條件進(jìn)行對(duì)比，色譜圖見圖1、2。

1—Clavulanate; 2—Penicilloic acids of amoxicillin; 3—Amoxicillin; 4—Amoxicillin diketopiperazines; 5—Amoxicillin ring-closed dimer; 6—Amoxicillin ring-closed trimer

1—Amoxicillin; 2—Amoxicillin ring-closed dime

相同濃度的阿莫西林克拉維酸系統(tǒng)適用性對(duì)照溶液用ChP2015年版方法檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)和分離度均優(yōu)于BP2018版方法。因此，本試驗(yàn)方法采用ChP2015收載本品有關(guān)物質(zhì)的色譜條件。

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：230 nm；柱溫：20 ℃；流速：1.0 mL?min-1；進(jìn)樣體積：20 μL；流動(dòng)相A：10 mmol?L-1磷酸二氫鉀溶液，用2 mol?L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0；流動(dòng)相B：流動(dòng)相A-乙腈（體積比20∶80）；洗脫方式：先以流動(dòng)相A-流動(dòng)相B（體積比98∶2）等度洗脫，待阿莫西林洗脫完畢后立即按表1進(jìn)行線性梯度洗脫。

Table 1 Mobile phase gradient

2.2 溶液的制備

2.2.1 系統(tǒng)適用性溶液的制備

取阿莫西林克拉維酸系統(tǒng)適用性對(duì)照品適量，加流動(dòng)相A溶解并稀釋制成每1 mL中約含阿莫西林克拉維酸2.5 mg的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液

2.2.2 對(duì)照溶液的制備

精密量取對(duì)照品適量，用流動(dòng)相A溶解并定量稀釋制成每1 mL中含阿莫西林（按C16H19N3O5S計(jì)）40 μg的溶液，作為對(duì)照溶液。

2.2.3 供試溶液的制備

取本品細(xì)粉適量，加流動(dòng)相A溶解并稀釋制成每1 mL中約含阿莫西林（按C16H19N3O5S計(jì)）2 mg的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為供試溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取本品、空白輔料、阿莫西林空白輔料和克拉維酸空白輔料分別經(jīng)酸、堿、高溫、氧化和光照強(qiáng)制降解樣品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，輔料空白和溶劑均不干擾兩主峰及有關(guān)物質(zhì)的測定；本品經(jīng)酸、堿、氧化、高溫和光照破壞后，兩主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均符合要求，各雜質(zhì)峰之間能夠有效分離；兩主峰峰純度均符合要求；阿莫西林空白和克拉維酸空白降解產(chǎn)生的雜質(zhì)均不干擾有關(guān)物質(zhì)測定；破壞前后物料平衡。

2.4 檢測限和定量限的確定

精密稱取阿莫西林對(duì)照品，用流動(dòng)相A溶解并逐步稀釋，按“2.1”條色譜條件進(jìn)行測定，阿莫西林最低檢測限為0.125 μg?L-1（/=3），最低定量限為0.416 μg?L-1（/=10）。

精密稱取克拉維酸對(duì)照品，用流動(dòng)相A溶解并逐步稀釋，按“2.1”條色譜條件進(jìn)行測定，克拉維酸最低檢測限為84 ng?L-1（/=3），最低定量限為0.280 μg?L-1（/=10）。

2.5 線性范圍的確定

精密稱取阿莫西林對(duì)照品適量，用流動(dòng)相A溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度約為0.9 g?L-1的溶液，作為阿莫西林對(duì)照儲(chǔ)備液；精密稱取克拉維酸對(duì)照品適量，用流動(dòng)相A溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度約為0.4 g?L-1的溶液，作為克拉維酸對(duì)照儲(chǔ)備液。分別精密量取阿莫西林對(duì)照儲(chǔ)備液和克拉維酸對(duì)照儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相A稀釋制成一系列質(zhì)量濃度的阿莫西林和克拉維酸對(duì)照混合溶液，作為供試溶液。分別精密量取供試溶液20 μL注入液相色譜儀，以阿莫西林峰面積（）對(duì)質(zhì)量濃度（）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程= 3.294 189 72×104+ 2 866.755 3，相關(guān)系數(shù)2= 1.000 0。結(jié)果表明，阿莫西林質(zhì)量濃度在0.025～82.665 mg?L-1內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系；以克拉維酸峰面積（）對(duì)質(zhì)量濃度（）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程= 2.006 629 61×104+ 1 102.031 0，相關(guān)系數(shù)2=1.000 0。結(jié)果表明，克拉維酸質(zhì)量濃度在0.012～40.968 mg?L-1內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取阿莫西林細(xì)粉，加流動(dòng)相A溶解并稀釋制成每1 mL中約含阿莫西林2 mg的溶液，作為供試溶液；精密量取上述溶液適量，用流動(dòng)相A定量稀釋制成每1 mL中含阿莫西林40 μg的溶液，作為對(duì)照溶液。分別將供試溶液和對(duì)照溶液在25 ℃和4 ℃條件下放置，每隔一定時(shí)間后精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察供試溶液中雜質(zhì)的含量變化。結(jié)果表明，供試溶液在25 ℃放置1 h、4 ℃放置7 h，各已知雜質(zhì)和總雜質(zhì)含量的RD均小于10.0%，且沒有出現(xiàn)新的雜質(zhì)，說明供試溶液在25 ℃放置1 h、4 ℃放置7 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 耐用性試驗(yàn)

分別考察“2.1”條色譜條件波長±2 nm、柱溫變化±2 ℃、流速變化±20%、流動(dòng)相pH值變化±0.2和流動(dòng)相比例乙腈±10%時(shí)，儀器色譜行為的變化。結(jié)果表明，波長±2 nm、柱溫±2 ℃、流速±20%、流動(dòng)相pH值±0.2及流動(dòng)相比例乙腈±10%時(shí)，阿莫西林克拉維酸系統(tǒng)適用性對(duì)照溶液的色譜圖均與標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致，供試溶液中含量大于0.1%的雜質(zhì)測得結(jié)果的RSD均小于10.0%，含量小于0.1%的雜質(zhì)測得含量的絕對(duì)值均小于0.05%，方法的耐用性好。

2.8 雜質(zhì)限度制定

2.8 .1 雜質(zhì)的定量方法

ChP2015年版[8]和BP2018版[9]收載的本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，雜質(zhì)含量計(jì)算均采用不加校正因子的自身對(duì)照法，按對(duì)照溶液中阿莫西林和克拉維酸峰面積的和計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的含量。自研制劑和參比制劑0 d及加速試驗(yàn)6個(gè)月的有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果表明，本品中檢出的有關(guān)物質(zhì)均為阿莫西林降解產(chǎn)生的雜質(zhì)，與克拉維酸有關(guān)的克拉維酸聚合物及其他熒光雜質(zhì)采用熒光分光光度法檢測。為了真實(shí)準(zhǔn)確的反映產(chǎn)品中有關(guān)物質(zhì)的含量，將現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中按對(duì)照溶液中阿莫西林和克拉維酸峰面積的和計(jì)算，改為按阿莫西林的峰面積計(jì)算。

2.8.2 已知雜質(zhì)的校正因子研究

根據(jù)阿莫西林和各雜質(zhì)對(duì)照品線性方程的斜率計(jì)算各雜質(zhì)的相對(duì)校正因子，結(jié)果見表2。

Table 2 Results of relative response factor of impurities

結(jié)果表明，阿莫西林噻唑酸、2’, 5’-二酮哌嗪-2（）阿莫西林和阿莫西林脫羧噻唑酸相對(duì)阿莫西林的校正因子均在0.9～1.1內(nèi)，計(jì)算時(shí)無需校正。因此本品的有關(guān)物質(zhì)定量方法采用不加校正因子的自身對(duì)照法，按對(duì)照溶液中阿莫西林的峰面積計(jì)算。

2.8.3 雜質(zhì)控制限度的制定

ChP2015年版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未規(guī)定特定雜質(zhì)限度，按對(duì)照溶液中阿莫西林和克拉維酸峰面積的和計(jì)算，控制單個(gè)雜質(zhì)≤2.5%，總雜質(zhì)≤7.0%。換算成擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的定量方法，按對(duì)照溶液中阿莫西林的峰面積計(jì)算，應(yīng)控制單個(gè)雜質(zhì)≤3.25%，總雜質(zhì)≤9.1%。

BP2018版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)阿莫西林二聚體作為特定雜質(zhì)進(jìn)行控制，其他均按未知單個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行控制，按對(duì)照溶液中阿莫西林和克拉維酸峰面積的和計(jì)算，控制阿莫西林二聚體≤2.0%，未知單雜質(zhì)≤1.0%。換算成擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的定量方法，按對(duì)照溶液中阿莫西林的峰面積計(jì)算，應(yīng)控制阿莫西林二聚體≤2.6%，未知單雜質(zhì)≤1.3%。

參考ChP2015年版和BP2018版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的雜質(zhì)控制限度，并結(jié)合仿制制劑和參比制劑的穩(wěn)定性考察結(jié)果，制定本品的雜質(zhì)控制限度，擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定已知雜質(zhì)阿莫西林噻唑酸、2’, 5’-二酮哌嗪-2（）阿莫西林、阿莫西林脫羧噻唑酸和雜質(zhì)X的限度均≤1.0%，阿莫西林閉環(huán)二聚體≤2.0%，其他未知單個(gè)雜質(zhì)≤1.0%，總雜質(zhì)≤5.0%，控制限度均嚴(yán)于ChP2015年版和BP2018版標(biāo)準(zhǔn)。

2.9 樣品測定

樣品信息見表3。

采用本試驗(yàn)擬定的有關(guān)物質(zhì)檢測方法，分別對(duì)3批仿制制劑和3批參比制劑的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測，5個(gè)已知雜質(zhì)及最大未知單雜質(zhì)、總雜質(zhì)均不高于參比制劑，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表4。

Table 3 Test sample information

Table 4 Related substance comparison result of self-developed product and reference product

3 討論

采用優(yōu)化后的本品有關(guān)物質(zhì)控制方法，歸屬于阿莫西林的雜質(zhì)含量計(jì)算結(jié)果要高于《中華人民共和國藥典》2015版收載本品的控制方法，能更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)胤治龇轮浦苿┡c參比制劑雜質(zhì)的一致性。本試驗(yàn)方法和試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)“阿莫西林克拉維酸鉀片”仿制藥一致性評(píng)價(jià)有一定的參考意義。

[1] 梁再賦. 國內(nèi)阿莫西林/克拉維酸鉀復(fù)方制劑的現(xiàn)狀[J]. 國外醫(yī)藥: 抗生素分冊(cè), 2006, 27(2): 96.

[2] 于芳. 阿莫西林克拉維酸鉀治療嬰幼兒急性上呼吸道感染的療效及安全性評(píng)價(jià)[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2015, 24(5): 528-529.

[3] 國務(wù)院辦公廳. 關(guān)于開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)的意見(2016年第8號(hào))[EB/OL]. (2016-03-05) [2019-03-05].http://www.gov.cn/zhengce/content/2016-03/05/content_5049364.htm.

[4] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 關(guān)于落實(shí)《國務(wù)院辦公廳關(guān)于開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)的意見》有關(guān)事項(xiàng)的公告（2016年第106號(hào)）[EB/OL]. (2016-05-26)[ 2019-03-05].http://samr.cfda.gov.cn/WS01/CL0087/ 154042.html.

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[8] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典: 二部[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2015: 435-436.

[9] British Pharmacopoeia Commission. British Pharmacopoeia[M]. [s.l.]: The Stationery Office, 2018: 399-401.

Comparative analysis of the impurity profiling consistency between amoxicillin and clavulanate potassium tablets and reference preparations

WANG Jingxin1,2，QIU Junxin2，DING Pingtian1

（1.,,110016,; 2..,050010,）

To evaluate the impurity profiling consistency between amoxicillin and clavulanate potassium tablets and reference preparations. MethodsThe HPLC conditions of related substance were determined by comparing analytical procedures and impurities limit recorded in ChP2015, USP41 and BP2018. Validation of analytical procedures and quantitation method optimization were performed. The impurity profiling of amoxicillin and clavulanate potassium tablets and reference preparations were compared with HPLC method determined above. Results Specificity, linearity, robustness and other validation characteristics of the established HPLC conditions of related substance were evaluated. The quality of preparation were reflected more truly by the optimized quantitation method of related substance. Conclusion The established analysis methods is suitable for controlling the related substances of amoxicillin and clavulanate potassium tablets. Impurity profiling of the generic preparations is consistent with reference preparations.

pharmaceutics; amoxicillin-clavulanate potassium tablet; HPLC; amoxicillin; clavulanate; related substances; impurity profiling

2019-03-05

王景欣(1976-),女(漢族), 河北石家莊人, 高級(jí)工程師,學(xué)士, 主要從事藥劑學(xué)研究, Tel. 0311- 86674086 , E-mail 13930465920@139.com。

R94

A

（2019）04–0115–07

10.14146/j.cnki.cjp.2019.04.004

(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)