王彥平，陳月英，賈彥杰，曹婭，宿時(shí)，婁芳慧

（河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南 鄭州 451450）

紫山藥多糖是紫山藥細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分，具有抗氧化[1]、免疫調(diào)節(jié)[2]、抗衰老[3-4]、降糖[5]、耐缺氧[6]等多種生物活性。目前研究紫山藥多糖的提取方法主要集中在熱水浸提法[7]、超聲波提取法[8]、微波提取法[9]和生物酶法提取[10]等，其中熱水浸提法耗時(shí)長(zhǎng)、溫度高、得率低、純度低，超聲波法提取時(shí)間短、得率高，但長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)破壞多糖活性[11]，微波法雖提取時(shí)間大為減少，但提取溫度難以控制，亦會(huì)破壞多糖活性。微波預(yù)處理-超聲波輔助提取法首先采用微波對(duì)經(jīng)水浸潤(rùn)的物料粉進(jìn)行0.5 min～3 min 微波預(yù)處理，利用微波的熱效應(yīng)使生物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜迅速破裂，然后進(jìn)行20 min～60 min 超聲波提取，利用超聲波空化作用、機(jī)械作用和熱效應(yīng)進(jìn)一步破壞生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，加快多糖釋放速度[12]。因此微波預(yù)處理-超聲波輔助提取法結(jié)合微波提取法和超聲波提取法的優(yōu)點(diǎn)，既能快速提取物料中的功能成分，也能避免微波或超聲波作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使多糖活性遭到破壞，是一種極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的提取技術(shù)，目前微波-超聲波輔助提取紫山藥多糖的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。

目前糖尿病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病之一。Ⅱ型糖尿病的主要癥狀之一是餐后高血糖，α-葡萄糖苷酶抑制劑作為臨床上常用的口服降糖藥物能夠抑制小腸內(nèi)蔗糖、麥芽糖的水解從而降低餐后血糖[13]。而合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有一定的毒副作用，因此從植物中篩選安全有效的天然α-葡萄糖苷酶抑制劑成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)方向。

本文采用微波預(yù)處理-超聲波輔助提取紫山藥多糖，對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用Sevag 法脫蛋白和醇沉后得紫山藥粗多糖，并對(duì)紫山藥多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力進(jìn)行研究，旨在為我國(guó)紫山藥活性物質(zhì)的綜合利用和規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紫山藥：產(chǎn)自廣西南寧。洗凈、瀝干、去皮、切片，于60 ℃烘干24 h，料理機(jī)粉碎后過(guò)50 目篩。干燥器中保存，備用。

阿卡波糖：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；4-硝基苯-α-D-吡楠葡萄糖苷（pNPG）：Sigma-Aldrich 公司；α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；乙醚、三氯甲烷、正丁醇、苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇、葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈉等均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

UV1901PCS 雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；BS224S 分析天平：德國(guó)賽多利斯公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海喬躍電子科技有限公司；D5-R2 離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；RE2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；202-3AB 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海喬躍電子科技有限公司；SCIENTZ-ⅡDM 微波光波超聲波萃取儀：寧波新芝有限公司。

1.3 溶液配制

磷酸鹽緩沖溶液（phosphatebufferedsolution，PBS）：稱(chēng)取 7.80 g 磷酸二氫鉀（NaH2PO4·2H2O）和 17.90 g磷酸氫二鉀（Na2HPO4·2H2O），分別用蒸餾水溶解定容至250 mL，配制成0.2 mol/L 的母液，再按 NaH2PO4∶Na2HPO4=51∶49 的體積比配制成 pH6.8 的 0.2 mol/L的PBS 溶液。

α-葡萄糖苷酶溶液：取1 mg α-葡萄糖苷酶粉末，用pH 6.8 的PBS 溶液溶解定容至50 mL，配制成濃度為1 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液。

4-硝基苯-Β-D-吡喃葡萄糖苷（4-Nitrophenyl-β-D- glucopyranoside，pNPG）溶液：稱(chēng)取 30.13 mg pNPG粉末，用pH 6.8 的PBS 溶液溶解定容至100 mL，配制成濃度為10 mmol/L 的pNPG 溶液。

碳酸鈉溶液：稱(chēng)取1.06 g 碳酸鈉粉末，用蒸餾水溶解定容至100 mL，配制成0.1 mol/L 的Na2CO3溶液。

阿卡波糖溶液：用pH 6.8 的PBS 溶液配制成不同濃度的阿卡波糖溶液。

紫山藥粗多糖溶液：將最佳工藝條件獲得的紫山藥粗多糖粉末，用pH 6.8 的PBS 溶液配制成不同濃度的多糖溶液。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法[14]，精密稱(chēng)取一定量105 ℃烘干至恒重的葡萄糖，分別制得濃度為0、6.0、18.0、30.0、42.0、54.0 μg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確移取 2.0 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL 容量瓶中，依次加入0.7 mL6%苯酚溶液和5.0 mL 濃硫酸，置沸水浴中顯色20 min，取出后至冷水中冷卻10 min，冷卻后去除靜置10 min，在488 nm 處測(cè)定其吸光度。以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 紫山藥粉預(yù)處理

將紫山藥粉用乙醚90 ℃回流脫脂2 h，乙醚揮發(fā)完全后，置于恒溫箱60 ℃干燥至恒重。

1.4.3 多糖的提取工藝流程

預(yù)處理紫山藥粉與水按一定料液比混合，采用微波預(yù)處理后，在60 ℃下進(jìn)行超聲波提取，將提取液離心（4 000 r/min，15 min）后取上清液。將上清液置于250 mL 具塞三角瓶中，按4∶1（體積比）比例加入Sevag（V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1）試劑[15]，搖床震蕩 30 min，置分液漏斗中靜置分層，棄下層膠狀變性蛋白質(zhì)層，取上面水層離心（8 000 r/min，10 min）后取上清液，重復(fù)操作3 次。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫減壓將上述上清液濃縮后，加入無(wú)水乙醇至終濃度為75%，靜置醇沉18 h[16]，離心（4 000 r/min，10 min）后棄上清液，收集得到粗多糖。

多糖得率/%=多糖質(zhì)量（g）/紫山藥粉質(zhì)量（g）×100

1.4.4 紫山藥粗多糖粉末中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

紫山藥粗多糖粉末在恒溫箱60 ℃下干燥至恒重，精確稱(chēng)取紫山藥多糖粉末20 mg，用水定容至250 mL做多糖儲(chǔ)備液。取多糖儲(chǔ)備液2.0 mL，按照1.4.1 中操作測(cè)吸光度。

多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%=多糖質(zhì)量（g）/紫山藥多糖粉末質(zhì)量（g）×100

1.4.5 單因素試驗(yàn)

微波預(yù)處理-超聲提取紫山藥多糖混合液，4 000 r/min 離心15 min 后取上清液得多糖粗提液，經(jīng)Sevag 法脫蛋白3 次后提取液，按照1.4.1 的方法測(cè)定粗提液的吸光度，并計(jì)算粗多糖得率。

1.4.5.1 料液比對(duì)粗多糖得率的影響

固定條件為微波功率300 W、微波時(shí)間30 s、超聲功率180 W、超聲時(shí)間20 min，設(shè)計(jì)料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）加入蒸餾水，考察不同料液比對(duì)粗多糖得率的影響。

1.4.5.2 微波功率對(duì)粗多糖得率的影響

固定條件為料液比 1∶30（g/mL）、微波時(shí)間 30 s、超聲功率180 W、超聲時(shí)間20 min，設(shè)計(jì)微波功率分別為 150、300、450、600、750 W 時(shí)預(yù)處理，考察微波功率對(duì)粗多糖得率的影響。

1.4.5.3 微波時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響

固定條件為料液比 1∶30（g/mL）、微波功率 300 W、超聲功率180 W、超聲時(shí)間20 min，設(shè)計(jì)微波時(shí)間分別為 10、20、30、40、50 s 預(yù)處理，考察微波時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響。

1.4.5.4 超聲功率對(duì)粗多糖得率的影響

固定條件為料液比 1∶30（g/mL）、微波功率 300 W、微波時(shí)間30 s、超聲時(shí)間20 min，設(shè)計(jì)超聲波提取功率分別為 90、180、270、360、450 W，考察超聲功率對(duì)粗多糖得率的影響。

1.4.5.5 超聲時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響

固定條件為料液比 1∶30（g/mL）、微波功率 300 W、微波時(shí)間30 s、超聲功率180 W，設(shè)計(jì)超聲波提取時(shí)間分別為 10、20、30、40、50 min，考察超聲時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響。

1.4.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出四因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

微波預(yù)處理-超聲波輔助提取紫山藥多糖混合液，離心后取上清液，經(jīng)Sevag 法脫蛋白3 次后提取液，按照1.4.1 方法測(cè)定粗提液的吸光度，并計(jì)算紫山藥粗多糖得率，以確定微波預(yù)處理-超聲波輔助法提取紫山藥多糖的最佳工藝條件。

1.4.7 紫山藥多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

參考文獻(xiàn)[17]測(cè)定方法，用移液槍移取不同濃度的阿卡波糖溶液和紫山藥多糖溶液各40 μL 于酶標(biāo)板中，再向各孔中加入40 μL α-葡萄糖苷酶溶液，混勻后 37 ℃反應(yīng) 10 min，取出后加入 30 μL pNPG 溶液，混勻后37 ℃反應(yīng)30 min，取出后加入90 μL 碳酸鈉溶液，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm 處吸光值A(chǔ)，同時(shí)設(shè)立空白組和背景組，計(jì)算抑制率。

抑制率/%=[A空白-（A樣品-A背景）]/A空白×100

式中：A空白為 PBS（40 μL）+α-葡萄糖苷酶（40 μL）+pNPG（30 μL）+碳酸鈉（90 μL）條件下測(cè)得的吸光值；A樣品為多糖溶液（40 μL）+ α-葡萄糖苷酶（40 μL）+pNPG（30 μL）+碳酸鈉（90 μL）條件下測(cè)得的吸光值；A背景為多糖溶液（40 μL）+PBS（40 μL）+pNPG（30 μL）+碳酸鈉（90 μL）條件下測(cè)得的吸光值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用excel 2007 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫山藥標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照“1.4.1”進(jìn)行操作，結(jié)果顯示葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度的線性回歸方程為：Y=0.016 4x+0.013 8，R2=0.999，表明在 0～54 μg/mL 范圍內(nèi)葡萄糖的濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

2.2 紫山藥多糖提取的單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)粗多糖得率的影響

料液比對(duì)粗多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，當(dāng)料液比由 1∶10（g/mL）降低到1∶40（g/mL）時(shí)，紫山藥粗多糖得率快速升高，在料液比為 1∶40（g/mL）達(dá)到最大值，說(shuō)明一定范圍內(nèi)，料液比越小即水越多，越有利于多糖的溶出；但當(dāng)水過(guò)多時(shí)可能會(huì)影響超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械振動(dòng)的效果，多糖得率反而下降[18]。故選擇料液比為1∶40（g/mL）較為適宜。

2.2.2 微波功率對(duì)紫山藥粗多糖得率的影響

微波功率對(duì)紫山藥粗多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

圖2 料液比對(duì)粗多糖得率的影響Fig.2 Effect of water-material ratio on polysaccharide yield

圖3 微波功率對(duì)粗多糖得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on polysaccharide yield

由圖3可知，隨著微波功率的提高，紫山藥粗多糖得率緩緩上升，當(dāng)微波功率達(dá)到450 W 后，粗多糖得率趨于平穩(wěn)。可能是由于微波可使紫山藥細(xì)胞壁遭到破壞，有利于多糖溶出，隨著微波功率的增大，溫度升高，部分多糖發(fā)生水解[19]。微波功率達(dá)到450 W 后，粗多糖得率趨于平穩(wěn)，考慮能源消耗，選擇微波功率150、300、450 W3 個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.3 微波時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響

微波時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 微波時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響Fig.4 Effect of microwave time on polysaccharide yield

由圖4可知，隨著微波預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，紫山藥粗多糖得率呈現(xiàn)向上升后下降的趨勢(shì)，微波預(yù)處理時(shí)間達(dá)到30 s 時(shí)得率最高。可能是由于在一定的范圍內(nèi)，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，紫山藥細(xì)胞破裂，多糖溶出增多，但過(guò)長(zhǎng)的微波預(yù)處理時(shí)間可能會(huì)使部分多糖水解。微波預(yù)處理時(shí)間達(dá)到30 s 時(shí)得率最高，選擇微波預(yù)處理時(shí)間20、30、40 s 3 個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.4 超聲功率對(duì)粗多糖得率的影響

超聲功率對(duì)粗多糖得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 超聲功率對(duì)粗多糖得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on polysaccharide yield

由圖5可知，當(dāng)超聲功率低于270 W 時(shí)，隨著超聲功率的增加，紫山藥粗多糖得率逐漸升高，但超聲功率超過(guò)270 W 后，粗多糖得率反而下降，可能由于超聲波具有較強(qiáng)的剪切作用，功率過(guò)高會(huì)導(dǎo)致多糖化學(xué)鍵斷裂，進(jìn)而影響紫山藥粗多糖得率[20]。超聲功率為270 W 時(shí)，紫山藥得率最高，選擇超聲波提取功率為180、270、360 W 3 個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.5 超聲時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響見(jiàn)圖6。

由圖6可知，超聲波提取時(shí)間低于40 min 時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，紫山藥粗多糖得率逐漸升高，當(dāng)達(dá)到40 min 后紫山藥粗多糖得率趨于平穩(wěn)，可能由于此時(shí)細(xì)胞壁的破壞趨于完全[20]。超聲時(shí)間為50 min 時(shí)，紫山藥的得率最高，考慮到能源消耗，選擇超聲波提取時(shí)間為30、40、50 min3 個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on polysaccharide yield

2.3 紫山藥多糖提取的正交試驗(yàn)

紫山藥多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 紫山藥粗多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test of extraction of purple yam diosgenin

正交試驗(yàn)結(jié)果分析表明，紫山藥粗多糖微波預(yù)處理-超聲波提取方法中各因素重要性的順序?yàn)锽＞A＞D＞C，即微波時(shí)間＞微波功率＞超聲時(shí)間＞超聲功率。最佳提取工藝為A2B2C2D1，即微波功率300 W、微波時(shí)間30 s、超聲功率270 W、超聲時(shí)間30 min。按最佳工藝條件提取紫山藥多糖，平行3 次，紫山藥粗多糖的平均得率為（11.12±1.06）%，高于正交試驗(yàn)中的最大值。醇沉后的紫山藥多糖粉末的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45.80%。

2.4 紫山藥多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

紫山藥多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用見(jiàn)圖7。

由圖7可知，隨著阿卡波糖濃度的增加，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率明顯增強(qiáng)；紫山藥粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率與質(zhì)量濃度之間也呈良好的對(duì)數(shù)關(guān)系。阿卡波糖的曲線方程為：Y=12.323ln（x）+119.89（R2=0.993 4），IC50=0.003 4（mg/mL）。紫山藥多糖的曲線方差為：Y=11.725ln（x）+82.797（R2=0.985 5），IC50=0.061 0（mg/mL）。結(jié)果顯示紫山藥粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，相同質(zhì)量濃度下，紫山藥多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用較阿卡波糖弱（p＜0.01）。

圖7 紫山藥多糖溶液濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.7 Effect of purple yam polysaccharide solution concentration on α-glucosinase activity

3 討論

本研究用微波預(yù)處理-超聲波輔助提取法從紫山藥中提取多糖，其最優(yōu)化工藝條件為為料液比1∶40（g/mL）、微波功率300 W、微波時(shí)間30 s、超聲功率270 W、超聲時(shí)間30 min。在最佳工藝條件下，紫山藥多糖平均得率為（11.12±1.06）%，多糖得率高于超聲提取法[8]。該工藝方法可縮短提取時(shí)間、提高多糖得率、節(jié)省提取劑、降低生產(chǎn)成本、多糖活性良好。

阿卡波糖或米格列醇的類(lèi)似物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用已經(jīng)被應(yīng)用在臨床，用于糖尿病的治療，可有效抑制小腸內(nèi)蔗糖、麥芽糖等水解為葡萄糖，從而降低餐后血糖。目前已從多種常見(jiàn)植物中分離制備出多糖用于抑制α-葡萄糖苷酶的研究[21]。宋曙輝等[5]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫山藥具有降低大鼠血糖的作用。杭悅宇[2]藥理試驗(yàn)結(jié)果表明，包括紫山藥在內(nèi)的多種山藥水提液具有明顯的降血糖作用。本研究通過(guò)α-葡萄糖苷酶活性體外抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在相同質(zhì)量濃度下，紫山藥多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力較阿卡波糖弱，但也表現(xiàn)出明顯的抑制活性。紫山藥多糖在試驗(yàn)濃度下，濃度與α-葡萄糖苷酶清除率呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，即濃度越高抑制能力越強(qiáng)。綜上所述，紫山藥多糖具有一定的體外降糖活性，其體內(nèi)外降糖活性及機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。