王冰聰，吳瓊，遲燕平

（1.長春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130022；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所，吉林 長春 130124）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），又稱4-氨基丁酸、氨酪酸，是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，分布非常廣泛[1]，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[2]，具有很多重要的生理功能，如控制高血壓[3]，治療癲癇病，延緩衰老，增進(jìn)腦活力[4]，安定神經(jīng)[5]，改善一系列保健和生理功能，如更年期綜合癥[6]。如今GABA 已經(jīng)發(fā)展成為一種新型的功能性因子[7]，被大量的利用在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域中[8-10]。制備GABA 的方法主要包括化學(xué)合成和生物合成兩大類?；瘜W(xué)合成法反應(yīng)速率快，但副產(chǎn)物較多，成本高，安全性低[11]。生物合成法是基于L-谷氨酸及其鈉鹽或富含谷氨酸的物質(zhì)，并且通過利用食品安全級(jí)的微生物如乳酸菌、曲霉菌和酵母菌等的發(fā)酵來生產(chǎn)[12]，其產(chǎn)品具有產(chǎn)量高，成本低，安全性高的優(yōu)點(diǎn)。

在本研究中，以在前期工作中篩選得到一株高產(chǎn)GABA 的乳酸菌L-SZ303 為研究對(duì)象，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)其產(chǎn)GABA 的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，從而提高GABA 產(chǎn)量。用米糠作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，為規(guī)?；昧畠r(jià)農(nóng)副產(chǎn)品生產(chǎn)食品奠定基礎(chǔ)，對(duì)于GABA 的發(fā)酵生產(chǎn)具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與儀器

乳酸菌菌株：農(nóng)產(chǎn)品加工所實(shí)驗(yàn)室保藏乳酸菌菌株L-SZ303。儲(chǔ)存條件為，在瓊脂斜面保藏培養(yǎng)基上傳代，保存于4 ℃冰箱，每兩周轉(zhuǎn)接一次[13]。

GABA 標(biāo)樣（≥99.9%）：Sigma 公司；L-谷氨酸鈉：中國醫(yī)藥集團(tuán)；米糠：農(nóng)村飼料；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

T-6vm 型分光光度計(jì)：南京菲勒儀器有限公司；HZQ-QX 全溫振蕩器：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；3K15 高速離心機(jī)：Sigma 公司。

1.2 培養(yǎng)基

菌株斜面保藏培養(yǎng)基：酪蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖5 g/L、乙酸鈉5 g/L、吐溫-80 10 mL、檸檬酸銨2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳 0.05 g/L，瓊脂 15 g/L，pH 6.6～6.8[14-15]。

發(fā)酵培養(yǎng)基（TYG 培養(yǎng)基）：胰蛋白胨5 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖10 g/L、丁二酸鈉5 g/L、L-谷氨酸鈉10 g/L，pH 6.6～6.8[16]。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)

將菌株L-SZ303 接入MRS 液體培養(yǎng)基中，放入35 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行搖培16 h，然后按2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接入TYG 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，35 ℃搖培發(fā)酵72 h。

1.3.2 定性定量分析

發(fā)酵液中GABA 定性：薄層層析法，展開劑組成為正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶3（體積比），0.4%的茚三酮作為顯色劑加入展開劑中，分別配制GABA 標(biāo)準(zhǔn)品和L-谷氨酸鈉1 g/L 用于定性參比，距離層析板底1 cm 點(diǎn)樣2 μL（直徑不超過4 mm），于層析缸中展開，然后于90 ℃下顯色10 min[17]。

發(fā)酵液中GABA 定量：Berthelot 比色法，在0.5 mL離心稀釋40 倍后的發(fā)酵液中加入0.2 mL 0.2 mol/L 硼酸鹽緩沖液（pH9.0），1 mL 6%苯酚和0.4 mL 9%次氯酸鈉。劇烈振蕩后，將混合物置于沸水中10 min，然后置于冰浴中20 min，并繼續(xù)振蕩直至出現(xiàn)藍(lán)色。最后，向混合物中加入2 mL 60%乙醇，并在645 nm 波長下測(cè)定其光密度值（OD645 nm）[18]。

1.3.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基

在對(duì)乳酸菌L-SZ303 發(fā)酵特性的初步了解基礎(chǔ)上，安排六因素三水平正交試驗(yàn)L27（36）研究葡萄糖、胰蛋白胨、丁二酸鈉、酵母粉、米糠、L-谷氨酸鈉對(duì)發(fā)酵產(chǎn)GABA 的影響，確定最佳的培養(yǎng)基配方。

1.3.4 優(yōu)化培養(yǎng)條件

1.3.4.1 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

以初始pH 值，發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時(shí)間3 個(gè)因素為自變量，以GABA 為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最優(yōu)的發(fā)酵條件。

1.3.4.2 模型驗(yàn)證

通過響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸菌L-SZ303 產(chǎn)GABA 發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，比較模型預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值，驗(yàn)證模型的有效性。

1.3.4.3 數(shù)據(jù)分析

采用Design Expert 7.0 軟件設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果采用Design Expert 7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，確定最佳培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將GABA 發(fā)酵培養(yǎng)基的6 種成分：葡萄糖、胰蛋白胨、丁二酸鈉、酵母粉、米糠、L-谷氨酸鈉，分別作為正交試驗(yàn)的6 個(gè)因素，安排三水平正交試驗(yàn)L2（736），因素和水平設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交設(shè)計(jì)的因素和水平取值表Table 1 Orthogonal design factors and level values

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Orthogonal design results table

續(xù)表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表Continue table 2 Orthogonal design results table

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

由方差分析可知，葡萄糖、胰蛋白胨、米糠、酵母粉、L-谷氨酸鈉均極顯著。由表2可知，6 個(gè)因素對(duì)發(fā)酵液中GABA 含量的影響大小依次為葡萄糖＞胰蛋白胨＞米糠＞酵母粉＞L-谷氨酸鈉＞丁二酸鈉，即培養(yǎng)基中葡萄糖和胰蛋白胨對(duì)GABA 的生成影響較為顯著，米糠次之，酵母粉，L-谷氨酸鈉和丁二酸鈉的影響程度相差不大。由表2可知6 個(gè)因素的最佳組合為A3B3C2D3E3F3，由于最佳條件不在這27 次試驗(yàn)中，所以做3 次驗(yàn)證試驗(yàn)A3B3C2D3E3F3取均值后得到GABA的含量為11.367 g/L，與最好的8 號(hào)試驗(yàn)進(jìn)行比較高于8號(hào)試驗(yàn)，由此得最佳的培養(yǎng)基組成配方為：葡萄糖15 g/L，胰蛋白胨25 g/L，丁二酸鈉2 g/L，酵母粉6 g/L，米糠6 g/L，L-谷氨酸鈉5 g/L。

2.2 培養(yǎng)條件的確定

根據(jù)Box-Behnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面分析（response surface methodology，RSM）試驗(yàn)，共有17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，以培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間3 個(gè)因素為自變量，以GABA含量為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素與水平的選取見表4。

表4 響應(yīng)面分析的因素和水平取值表Table 4 Factors and levels of response surface analysis

17 組試驗(yàn)可分為兩類：1～12 是析因試驗(yàn)，13～17是中心試驗(yàn)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差，響應(yīng)面分析試驗(yàn)安排及每次試驗(yàn)得到的GABA 的含量（g/L）見表5，回歸分析見表6。

表5 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 5 Box-Behnken test design and response values

表6 方差分析表Table 6 Analysis of variance

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，通過響應(yīng)面分析軟件分析數(shù)據(jù)，以GABA 產(chǎn)量為響應(yīng)值，得到回歸方程表達(dá)為：Y=13.38+0.086X1+0.18X2+0.1X3-0.11X1X2-0.031X1X3-4.0×10-3X2X3-0.25X12-0.91X22-0.21X32。

由方差分析得出P 值，模型極顯著，模型的失擬性不顯著，回歸決定系數(shù)R2=0.985 2，修正決定系數(shù)R2Adj=0.966 2，說明方程具有良好的擬合性，可以應(yīng)用于對(duì)發(fā)酵條件優(yōu)化的分析預(yù)測(cè)。根據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析：一次項(xiàng) X1、X2、X3顯著。由表6可知，影響 GABA 產(chǎn)量的因素由大到小排序依次是發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、初始pH 值。發(fā)酵條件交互因素響應(yīng)面立體分析見圖1。

數(shù)據(jù)分析表明回歸模型存在最大值，最佳發(fā)酵條件為：初始pH6.83、發(fā)酵溫度36.27 ℃、發(fā)酵時(shí)間3.23 d，此條件下理論預(yù)測(cè)最大值為13.403 4 g/L。由于實(shí)際情況，取發(fā)酵條件為：初始pH6.8、發(fā)酵溫度36 ℃、發(fā)酵時(shí)間3 d 進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)取平均值得GABA 產(chǎn)量為13.375 g/L，基本與預(yù)測(cè)值一致。

圖1 發(fā)酵條件交互因素響應(yīng)面圖Fig.1 Fermentation condition interaction factor response surface diagram

3 結(jié)論

通過正交試驗(yàn)和響應(yīng)面的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以GABA 產(chǎn)量為指標(biāo)，采用比色法對(duì)發(fā)酵中GABA 含量進(jìn)行測(cè)定，優(yōu)化了乳酸菌L-SZ303 產(chǎn)GABA 發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件。確定了乳酸菌L-SZ303 產(chǎn)GABA 的最佳培養(yǎng)基配方：葡萄糖15 g/L，胰蛋白胨25 g/L，丁二酸鈉2 g/L，酵母粉 6 g/L，米糠 6 g/L，L-谷氨酸鈉 5 g/L。最適發(fā)酵條件：初始pH6.8、發(fā)酵溫度36 ℃、發(fā)酵時(shí)間3 d。試驗(yàn)結(jié)果有良好的重現(xiàn)性，GABA 產(chǎn)量達(dá)13.375 g/L。