劉曉英，劉光榮，唐健，車飆

（無限極(中國(guó))有限公司，廣東廣州 510663）

皮膚色素沉著源自于位于基底層的黑色素細(xì)胞，之后通過黑色素細(xì)胞樹突轉(zhuǎn)移周圍的角質(zhì)形成細(xì)胞中[1]。黑色素形成過程復(fù)雜，受多種內(nèi)外因素如紫外輻射或藥物等影響。黑素體是黑色素細(xì)胞特有的細(xì)胞器，包含黑色素合成4個(gè)階段需要的多種酶。黑色素細(xì)胞蛋白PMEL（黑素體前體蛋白）是黑素體從階段1到階段2的關(guān)鍵蛋白，與內(nèi)部形成結(jié)構(gòu)基質(zhì)纖維有關(guān)[2]。酪氨酸酶作為黑色素合成的限速酶也存在于黑色素體階段2中[3-5]。

當(dāng)黑色素合成完成，黑素體將從核周區(qū)轉(zhuǎn)移到黑色素細(xì)胞樹突，通過rab27a形成的復(fù)合體與肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合[4]。在人的表皮中，每個(gè)黑色素細(xì)胞通過樹突與30～40成纖維細(xì)胞結(jié)合，通過質(zhì)膜小泡將成熟的黑素體轉(zhuǎn)運(yùn)到角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，以保護(hù)DNA免受UV破壞[6-8]。

小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MITF是黑色素合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它的磷酸化形式調(diào)控黑色素合成酶的表達(dá)[9-10]。SCF/KIT通路激活MITF轉(zhuǎn)錄因子，角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的SCF與其受體KIT結(jié)合誘導(dǎo)鈣通路，KIT是Ⅲ型酪氨酸激酶跨膜受體[11]。然而，在人皮膚外植體中注射SCF會(huì)增加黑色素細(xì)胞數(shù)量，大小及樹突的形成，而截?cái)嗔薙CF及KIT的結(jié)合將抑制這些效果[12]。

UV是誘導(dǎo)黑色素生成的最重要外界因素。UV照射增加表皮黑色素主要是UVB的作用[13-15]。曬黑主要是由于黑素細(xì)胞的增殖或積聚，通過增加黑色素合成酶增加黑色素的合成，增加樹突數(shù)量和黑素體往角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)移[16]。UV照射黑色素細(xì)胞增加POMC（阿黑皮素，αMSH前體）的表達(dá)和受體MC1-R（黑素皮質(zhì)素1受體）的表達(dá)，導(dǎo)致αMSH的產(chǎn)生并激活黑色素合成酶及其他信號(hào)因子的表達(dá)[17]。此外，UV照射后，角質(zhì)形成細(xì)胞也通過旁分泌內(nèi)皮素(ET-1)和POMC影響黑色素形成[18-19]。

1 材料與方法

1.1 皮膚等效模型

帶黑色素皮膚模型，購(gòu)自法國(guó)LabSkin Creations。皮膚模型的構(gòu)建方法參考Dos Santos等于2015年發(fā)表的文章[20]。培養(yǎng)至第7代的成纖維細(xì)胞以250 000 cells/cm2接種于膠原糖胺聚糖真皮支架中，增殖并合成細(xì)胞外基質(zhì)，從而形成真皮類似物[21]。在真皮類似物培養(yǎng)基中培養(yǎng)28天后，將角質(zhì)形成細(xì)胞以250 000 cells/cm2接種于真皮等效物中以形成皮膚等效模型[22]。

皮膚等效模型在角質(zhì)形成培養(yǎng)基中浸泡1周后，上升至氣液交界面，培養(yǎng)45天后，角質(zhì)形成細(xì)胞完全分化為成熟表皮。第35天，在培養(yǎng)基中加入0.2%白百合細(xì)胞提取物及0.03%珍珠水解殼聚糖蛋白，與無活性成分培養(yǎng)的重組皮膚模型進(jìn)行對(duì)比。培養(yǎng)45天后，部分等效模型使用UVB 100 mJ/cm2照射，照射后24 h，樣品凍于-80 ℃或使用4%的福爾馬林固定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件每種固定方法各3個(gè)樣品。

1.2 基因表達(dá)分析

提取皮膚等效模型的總RNA后，使用NextSeq 500高通量測(cè)序，每個(gè)樣本讀取4 000萬次。與人類基因組進(jìn)行比對(duì)后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組結(jié)果進(jìn)行差異分析，尋找被下調(diào)的通路，重點(diǎn)關(guān)注與黑色素生成相關(guān)的基因。

1.3 組織學(xué)染色

固定包埋后的樣品切成5 μm的薄片，HPS（蘇木精-根皮紅-藏紅花）染色以觀察皮膚模型的結(jié)構(gòu)。脫蠟至水后使用3種染色劑（蘇木精-根皮紅-藏紅花）染色5 min，切片脫水處理后放入疏水介質(zhì)中。

為了評(píng)價(jià)黑色素合成，使用改良的Warthin Starry銀染試劑盒檢測(cè)等效模型的黑色含量（Merck）。脫蠟及再水化后，切片使用6%的硝酸銀溶液孵育20 min，清水洗以停止銀染。之后使用對(duì)苯二酚及明膠混合物孵育20 s。這一步使得黑色素由深棕色變成黑色，皮膚模型由黃色變成橙色。

1.4 免疫熒光

使用 4% 甲醛固定 20 min 用含 3% Triton100 PBS打孔。使用含有4%BSA的PBS封閉30 min以避免非特異結(jié)合。一抗孵育過夜，抗體如下:黑色素細(xì)胞PMEL（兔抗）、KIT（鼠抗），PBS洗3次。二抗為Alexa-568 鼠抗或兔抗，室溫孵育1 h。細(xì)胞核用Hoechst染色（Thermo Fisher Scientific）。

1.5 圖像采集及分析

免疫染色及組織學(xué)染色圖像采集使用Axio observer D1熒光顯微鏡（蔡司）觀察。使用HRc AxioCam鏡頭和ZEN 2軟件捕獲圖像，保存為TIFF格式。使用IMAGEJ軟件進(jìn)行圖像處理及分析。對(duì)所有數(shù)據(jù)，使用單因素T測(cè)試分析統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，表示為*P＜0.05，**P＜0.01，**P＜0.001。對(duì)于黑色素表達(dá)分析，黑色像素代表表皮黑色素，與其他像素區(qū)分。數(shù)據(jù)根據(jù)基底膜的長(zhǎng)度進(jìn)行歸一化，結(jié)果用μm2/μm表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 帶色素皮膚模型的構(gòu)建

對(duì)重組皮膚進(jìn)行組織學(xué)染色，未處理組結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞定植于膠原-糖胺聚糖-殼聚糖支架中，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)形成真皮類似物。表皮完成了從基底層到角質(zhì)層的分化。如圖1所示，紫外線照射后24 h，表皮中被曬傷的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮現(xiàn)象。

圖1 使用蘇木精-根皮紅-藏紅花對(duì)重組皮膚模型染色

2.2 皮膚模型黑色素含量分析

如圖2所示，使用改良的Warthin Starry染色法對(duì)重組皮膚模型的表皮進(jìn)行染色，黑色顆粒未黑色素。圖像分析顯示，UVB照射后，重組皮膚模型黑色素生成明顯增加。UVB照射與否，加入白百合細(xì)胞提取物后，重組皮膚模型黑色素含量與其對(duì)照組相比都明顯減少。

圖2 表皮黑色素的表達(dá)

（a）Warthin Starry 染色，棕色顆粒為黑色素。每個(gè)樣品取3張圖片進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。（b）表皮長(zhǎng)度歸一化后，自動(dòng)定量分析表皮黑色素面積。統(tǒng)計(jì)分析:t- 測(cè)試，** p ＜ 0.05 *** p ＜ 0.001。

2.3 PMEL表達(dá)分析

使用免疫熒光檢測(cè)表皮基底層黑色素相關(guān)蛋白PMEL的表達(dá)。PMEL與黑色素從黑色素細(xì)胞到角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)。如圖3所示，對(duì)比空白對(duì)照組，UVB照射后PMEL表達(dá)顯著增加。對(duì)比UVB照射組，加入白百合細(xì)胞提取物后，PMEL表達(dá)顯著下降。

表皮長(zhǎng)度歸一化后，自動(dòng)定量分析免疫熒光PMEL陽性面積。統(tǒng)計(jì)分析:t-測(cè)試，** p＜0.05，*** p ＜ 0.001。

2.4 關(guān)鍵基因蛋白表達(dá)情況

將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均一化處理后，進(jìn)行了不同組別基因表達(dá)的比較，發(fā)現(xiàn)了與黑色素合成相關(guān)通路的差異表達(dá)基因——kit基因。KIT與MITF的磷酸化相關(guān)。

圖3 表皮黑色素細(xì)胞蛋白PMEL表達(dá)

使用Image J對(duì)免疫熒光圖像進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4，UVB照射組與空白對(duì)照組沒有明顯差異。而在UVB照射組及空白組中加入白百合細(xì)胞提取物后，都明顯減少KIT蛋白的表達(dá)。

圖4 表皮KIT蛋白表達(dá)

總表皮面積歸一化后，自動(dòng)定量分析免疫熒光KIT陽性面積。統(tǒng)計(jì)分析:t-測(cè)試，*** p＜0.001。

3 結(jié)論

皮膚模型培養(yǎng)第10天，將白百合葉細(xì)胞提取物加入培養(yǎng)基中。隨后使用100 mJ/cm2UVB照射重組皮膚。對(duì)于有無照射UVB的皮膚，白百合葉細(xì)胞提取物減少皮膚模型黑色素含量。白百合葉細(xì)胞提取同時(shí)調(diào)控黑色素從黑色素細(xì)胞到角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，通過下調(diào)PMEL蛋白的表達(dá)。

初步研究表明，白百合葉細(xì)胞提取物具有抑制皮膚色素沉著的效果。而筆者嘗試尋找其作用機(jī)理，進(jìn)一步研究與色素沉著相關(guān)基因的表達(dá)。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)試，筆者發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與黑色素生成相關(guān)的基因——kit基因。UVB照射后，kit基因表達(dá)上調(diào)。KIT是角質(zhì)形成細(xì)胞分泌干細(xì)胞生長(zhǎng)因子SCF的受體，SCF/KIT通路與轉(zhuǎn)錄因子小眼相關(guān)因子（MITF）的激活相關(guān)，而MITF是黑色素合成酶表達(dá)調(diào)控的主要轉(zhuǎn)錄因子。

使用白百合細(xì)胞提取物處理UVB照射后的皮膚模型，KIT基因表達(dá)及蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。與之前研究一致，SCF/KIT通路與UVB誘導(dǎo)的體內(nèi)體外皮膚色素沉著的機(jī)制有密切關(guān)系[23]。已有報(bào)道證明，其他植物提取物通過影響KIT蛋白的表達(dá)下調(diào)黑色素細(xì)胞黑色素的生成[24]，但本課題是首次利用重組皮膚模型，證明植物提取物通過抑制KIT的表達(dá)達(dá)到美白效果。