賈玉萍，趙建文，李維煥，蓋宇鵬，程顯好＊

（1.魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264000；2.煙臺(tái)東方科技蛋白有限公司，山東招遠(yuǎn) 265400）

γ-聚谷氨酸是由L-谷氨酸和D-谷氨酸單體通過(guò)γ-酰胺鍵聚合而成的一種多肽分子，具有水溶性、生物可降解性、生物相容性、金屬螯合性、可食無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，在農(nóng)業(yè)[3-4]、環(huán)保[5]、醫(yī)藥[6]、食品[7]和化妝品[8]領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。目前，γ-聚谷氨酸主要通過(guò)化學(xué)合成、酶轉(zhuǎn)化、提取、微生物發(fā)酵生產(chǎn)。早在1937年，Ivanovie等[9-10]從炭疽芽孢桿菌的莢膜中發(fā)現(xiàn)。隨后Bovarniek等[11]研究發(fā)現(xiàn)，有些芽孢桿菌屬細(xì)菌能在發(fā)酵培養(yǎng)基中分泌γ-聚谷氨酸。之后，微生物法發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的研究成為熱點(diǎn)。和前三種方法相比，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、易于調(diào)控、適用于大規(guī)模生產(chǎn)。微生物深層發(fā)酵所需原料價(jià)格較高，是目前市場(chǎng)價(jià)格居高不下的主要原因，因此，使用低成本的原料是降低γ-聚谷氨酸成本的關(guān)鍵。許多研究者都在尋找更廉價(jià)的組分，廢料成為重要的方向之一[12-14]。Dan Zhang等[15]報(bào)道了利用未處理的甘蔗糖蜜和谷氨酸鈉廢液發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，環(huán)保、經(jīng)濟(jì)，通過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵72 h使得γ-聚谷氨酸產(chǎn)量達(dá)到52.1 g/L。Chao Zhang等[16]研究了以魚(yú)粉廢水為廉價(jià)氮源，利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，產(chǎn)量達(dá)到25.07 g/L。雖然皆利用廢液通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，降低了生產(chǎn)成本，但是發(fā)酵周期長(zhǎng)。

粉絲行業(yè)作為山東省招遠(yuǎn)市的支柱產(chǎn)業(yè)之一，占據(jù)了我國(guó)粉絲加工業(yè)的半壁江山。廢水問(wèn)題是粉絲行業(yè)存在的重要共性問(wèn)題，每噸粉絲原料加工都伴隨著12～15 t高濃度有機(jī)廢水的產(chǎn)生，招遠(yuǎn)市每年產(chǎn)生的粉絲廢水達(dá)600萬(wàn)噸以上。這些廢水中含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維、低聚糖等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，COD、BOD、SS等指標(biāo)極高，但此類(lèi)污水治理難度大、投入成本高，同時(shí)造成了資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。所以如何將此類(lèi)廢水資源化利用，符合既要“金山銀山”又要“綠水青山”的綠色生態(tài)生產(chǎn)理念。

本研究以粉絲加工廢水為原料生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，不僅可以解決粉絲加工行業(yè)廢水處理問(wèn)題，抵消廢水處理成本，還可以解決γ-聚谷氨酸生產(chǎn)成本過(guò)高、使用局限的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

葡萄糖、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、谷氨酸鈉、磷酸氫二鉀，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器

CP21電子天平、SBA-40E型生物傳感分析儀、FE20 pH計(jì)、LCT-IDS-A凈化工作臺(tái)、HZQ-Q全溫振蕩器、LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器、鼓風(fēng)干燥箱、HPS-400生化培養(yǎng)箱、凱氏定氮儀等。

1.1.3 試驗(yàn)菌種及廢水

試驗(yàn)菌種:已提交至中國(guó)微生物菌種保藏中心保藏的菌株 Bacillus subtilis LD-9308。

粉絲廢水:本研究中所用到的粉絲廢水來(lái)自于煙臺(tái)東方蛋白科技有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基:蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、NaCl 0.5%、瓊脂 2%，pH7.2。

（2）液體培養(yǎng)基（g/L）:蛋白胨1%、牛肉0.3%、NaCl 0.5%，pH7.2。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）:葡萄糖2%、谷氨酸鈉2%、磷酸氫二鉀0.15%、粉絲廢水，pH7.5。

1.2 培養(yǎng)條件

（1）斜面培養(yǎng):挑取保藏菌種接種至斜面培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～24 h，作為活化菌種備用。

（2）種子培養(yǎng):挑取一環(huán)活化菌種接至盛有100 mL種子液的500 mL搖瓶中，置于搖床中37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，作為種子液備用。

（3）發(fā)酵培養(yǎng):吸取上述種子液1 mL至含有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，放置于搖床培養(yǎng)，37 ℃，200 r/min培養(yǎng) 26 h，得到 γ- 聚谷氨酸發(fā)酵液。

（4）測(cè)定方法:高效液相色譜法（HPLC），按照企業(yè)標(biāo)準(zhǔn) Q/FSK 001—2012。

1.3 試驗(yàn)方案

1.3.1 粉絲加工廢水組成及特征參數(shù)測(cè)定

（1）pH:pH計(jì)測(cè)定。

（2）固體含量:取一定量粉絲加工廢水在105～110 ℃烘干后，稱(chēng)重。

（3）粗蛋白含量:凱氏定氮法測(cè)定，GB/T5009.5-2016。

（4）還原糖:高錳酸鉀滴定法，GB/T5009.7-2016。

（5）化學(xué)需氧量（COD）:重鉻酸鉀法，GB/T11914-1989。

1.3.2 單因素條件優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

（1）葡萄糖含量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別以0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%、3.50%、4.00%、4.50%和5.00%的葡萄糖含量梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來(lái)考察葡萄糖含量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響。

（2）谷氨酸鈉含量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別設(shè)置2%、3%、4%、5%和6%含量梯度的單因素條件，測(cè)定γ-聚谷氨酸產(chǎn)量。

（3）磷酸氫二鉀含量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別設(shè)置0%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%和0.50%的磷酸氫二鉀含量梯度的單因素條件，測(cè)定不同含量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響。

1.3.3 單因素條件優(yōu)化發(fā)酵條件

（1）發(fā)酵時(shí)間?？疾觳煌l(fā)酵時(shí)間20、22、24、25、26、28 h 和 30 h 下 γ- 聚谷氨酸的產(chǎn)量，以確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

（2）初始pH。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值分別為6.00、6.50、7.00、7.25、7.50、7.75、8.00，發(fā) 酵 培養(yǎng)一定時(shí)間，測(cè)定γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量。

1.3.4 正交試驗(yàn)發(fā)酵工藝優(yōu)化

利用SPSS軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上對(duì)培養(yǎng)基配方中葡萄糖含量、谷氨酸鈉含量、磷酸氫二鉀含量行正交試驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行，測(cè)定γ-聚谷氨酸含量，以選出最優(yōu)組合。因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 粉絲加工廢水組成及特征參數(shù)結(jié)果

測(cè)定10個(gè)批次的廢水成分，其組成及特征結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，受前段生產(chǎn)工藝的影響，廢水的固形物含量會(huì)有波動(dòng)，但其pH值、碳氮比比較穩(wěn)定。

表2 粉絲加工廢水組成及特征

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 單因素條件優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基結(jié)果與分析

（1）葡萄糖含量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響。葡萄糖含量在0.5%～2.0%時(shí)，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量隨葡萄糖含量的增加而增多，在2.0%時(shí)產(chǎn)量最高，高達(dá)31.76 g/L。之后，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量隨葡萄糖含量增加而下降，結(jié)果如圖1所示。葡萄糖是微生物生長(zhǎng)所需能量的重要來(lái)源，葡萄糖含量對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的積累有很重要的影響。

圖1 葡萄糖含量與γ-PGA產(chǎn)量的關(guān)系

（2）谷氨酸鈉含量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響。如圖2所示，谷氨酸鈉含量在2%～5%時(shí)，γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量隨著谷氨酸鈉含量的增加而增加，在5%最高可達(dá)41.89 g/L，之后開(kāi)始下降。由于谷氨酸鈉是合成γ-聚谷氨酸的前體物，在添加谷氨酸鈉的情況下，γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量能夠得到較大的提升，但過(guò)高的前體物存在反而會(huì)抑制γ-聚谷氨酸的生成。

（3）磷酸氫二鉀含量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響。磷酸氫二鉀對(duì)γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量影響較大，其含量在0.25%時(shí)γ-PGA產(chǎn)量最高，超過(guò)0.25%以后，產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)，如圖3所示。

圖2 谷氨酸鈉含量與γ-PGA產(chǎn)量的關(guān)系

圖3 磷酸氫二鉀含量與γ-PGA產(chǎn)量的關(guān)系

2.2.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

（1）發(fā)酵時(shí)間。如圖4所示，發(fā)酵時(shí)間為20～26 h時(shí)，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量隨時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，在26 h時(shí)最高，達(dá)49.16 g/L，隨后產(chǎn)量開(kāi)始下降，因此確定26 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。發(fā)酵時(shí)間對(duì)于目標(biāo)產(chǎn)物的積累具有很重要的影響。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物降解，時(shí)間過(guò)短會(huì)使得產(chǎn)物不足。在發(fā)酵過(guò)程中，不僅要滿(mǎn)足發(fā)酵生產(chǎn)中菌種對(duì)于營(yíng)養(yǎng)條件的要求，還需要維持菌種適宜的發(fā)酵培養(yǎng)條件的穩(wěn)定。

圖4 發(fā)酵時(shí)間與γ-PGA產(chǎn)量的關(guān)系

（2）初始pH。如圖5所示，pH值在6.0～7.5范圍內(nèi)，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量隨pH的增長(zhǎng)而增加，在7.5產(chǎn)量最高達(dá)50.68 g/L，之后產(chǎn)量開(kāi)始下降。

發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基的pH值對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成有很大的影響。pH是反映微生物發(fā)酵過(guò)程當(dāng)中培養(yǎng)條件是否穩(wěn)定的重要指標(biāo)，是一項(xiàng)重要的發(fā)酵參數(shù)，酸堿度的變化很大程度上影響著菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)。pH值的變化在調(diào)節(jié)酶活、維持微生物細(xì)胞的運(yùn)輸機(jī)制等方面都起著重要作用，pH值的變化也會(huì)促進(jìn)或抑制一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，甚至能夠影響菌體的生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物的合成，因此確定發(fā)酵過(guò)程的最適pH值是保證或提高產(chǎn)量的重要環(huán)節(jié)[17]。

圖5 pH與γ-PGA產(chǎn)量的關(guān)系

2.3 正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分含量?jī)?yōu)化結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，B因素是影響指標(biāo)值的最主要因素，即谷氨酸鈉含量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響最大。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

各因素對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量影響主次順序?yàn)锽＞A＞C，最佳組合為A2B3C3，在初始pH為7.5，發(fā)酵時(shí)間26 h的條件下，得到γ-聚谷氨酸產(chǎn)量為53.7 g/L。

3 結(jié)論

為了實(shí)現(xiàn)資源合理利用、降低聚谷氨酸生產(chǎn)成本，利用粉絲廢水發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸，并優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基配方及條件:葡萄糖2%，谷氨酸鈉5%，磷酸氫二鉀0.3%，初始pH值7.5，121 ℃滅菌20 min，500 mL 三角瓶，裝液量 100 mL，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，37 ℃振蕩培養(yǎng) 26 h。

聚谷氨酸作為一種新型、高效的農(nóng)肥和植物增產(chǎn)劑，能親水保水、平衡土壤酸堿度、結(jié)合沉淀重金屬、增強(qiáng)植物抗病抗逆能力。目前限制其在農(nóng)業(yè)大規(guī)模推廣應(yīng)用的主要因素是價(jià)格高。本研究以粉絲加工廢水為主要原料生產(chǎn)農(nóng)用聚谷氨酸，降低產(chǎn)品生產(chǎn)成本的同時(shí)，也消除了難以處理的廢水，節(jié)約了企業(yè)污水處理費(fèi)用。通過(guò)原料創(chuàng)新、工藝創(chuàng)新，使產(chǎn)品生產(chǎn)成本大大降低，經(jīng)濟(jì)效益、環(huán)境效益顯著。