刁海平,侯翠英,趙明日,孫 力

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264000)

紅藻主要分布在海洋中,以底棲大型藻類為主,富含R-藻紅蛋白(phycoerythrin, PE),其含量可高達(dá)R-藻藍(lán)蛋白(或R-別藻藍(lán)蛋白)含量的6～8倍,這意味著在紅藻藻膽體的棒結(jié)構(gòu)域中,1個(gè)六聚體藻藍(lán)蛋白對(duì)應(yīng)有6～8個(gè)六聚體藻紅蛋白,與藍(lán)藻藻膽體相比,這種高比例R-藻紅蛋白含量不僅給紅藻藻膽體結(jié)構(gòu)研究帶來諸多困難[1-3],而且成為探究紅藻藻膽體中R-藻紅蛋白的結(jié)構(gòu)特性、相互機(jī)制及其在棒結(jié)構(gòu)域中的組裝方式等紅藻藻膽體結(jié)構(gòu)功能的關(guān)鍵內(nèi)容之一．雖然有關(guān)藻膽體的研究始于單細(xì)胞紅藻紫球藻(Porphyridiumcruentum),但到目前為止關(guān)于藻膽體結(jié)構(gòu)功能研究報(bào)道主要來自藍(lán)藻[4-6],紅藻尤其是大型紅藻藻膽體的研究報(bào)道很有限,近些年在紅藻藻膽體結(jié)構(gòu)功能方面出現(xiàn)了一些進(jìn)展性的研究報(bào)道,如紫球藻半球形藻膽體在類囊體膜上的分布及其與代謝的相關(guān)性[1,7], 藻膽體與與光反應(yīng)系統(tǒng)的能量傳遞[8-9],藻膽體連接多肽[10]和以冷凍電鏡為基礎(chǔ)的紅藻Griffithsiapacifica的Block-type藻膽體的模擬重構(gòu)研究[11]．本實(shí)驗(yàn)所用的材料為海生紅藻多管藻,屬于紅藻門,真紅藻綱,仙菜目,松節(jié)藻科,多管藻屬,是中國黃渤海及東海沿岸常見的種類,在實(shí)驗(yàn)室前期研究工作中順序進(jìn)行離子交換層析和兩種凝膠過濾(Sephadex G-150 (G-150), Sephacry S-300 (S-300)),從多管藻(Polysiphoniaurceolata)中分離純化出2種分子質(zhì)量相同的R-PE(R-PEI和R-PEII)[12]．這一結(jié)果證明,多管藻含有在表面電荷特性上表現(xiàn)出差異的2種不同結(jié)構(gòu)類型的六聚體R-藻紅蛋白,但非變性等電聚焦分析表明含量高的R-PEII為單一窄帶,而含量較小的R-PEI為一較寬的條帶．R-PEI的這種寬帶揭示離子交換層析所得R-PEI組分可能還沒有達(dá)到完全均一的程度．

為進(jìn)一步研究確定多管藻中2種R-PE的結(jié)構(gòu)特性,本研究依據(jù)多維層析原理,在凝膠過濾(S-300)分離之后聯(lián)合使用DEAD SepharoseFast Flow離子交換層析和Butyl Sepharose 4 Fast Flow疏水相互作用層析,借助于靜電荷與疏水性這2種結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行R-PE分離純化．這一結(jié)果將為多管藻藻膽體中R-藻紅蛋白之間形成復(fù)合體,實(shí)現(xiàn)棒結(jié)構(gòu)域組裝及其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提供一定的數(shù)據(jù)與理論支持．

1 材料與方法

1.1 藻膽蛋白樣品提取[13]

本實(shí)驗(yàn)的材料多管藻采于2月下旬煙臺(tái)棧橋附近海域．將采集的多管藻浸泡在質(zhì)液體積比為1∶3的50 mmol/L磷酸緩沖液(PBS,pH值7.0) 中48～72 h,抽濾、離心(15 000 ×g,8 ℃,15 min)除不溶物,收集上清液用1 000 kU和50 kU膜包,收取50～1 000 kU的蛋白并濃縮至R-PE的A498(498 nm的吸光度)約為7.0．濃縮后的藻膽蛋白提取液避光于4 ℃冰箱冷藏保存,用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)．

1.2 2種藻紅蛋白的分離純化

1.2.1 S-300凝膠過濾層析[14]參考本實(shí)驗(yàn)室前期工作,使用Sephacry S-300(10～1 500 kU) (Vt=5 cm×48 cm)凝膠過濾對(duì)多管藻藻膽蛋白提取液初步分離．凝膠過濾時(shí)用280 nm光吸收(A280)實(shí)時(shí)跟蹤、檢測洗脫曲線．以層析樣品中A498/A280值為參照,按照洗脫曲線的洗脫峰收集R-PE組分,使用50 kU超濾膜包將所得藻紅蛋白樣品濃縮至A498約為2．避光于4 ℃冷藏保存樣品,用于下一步分離純化．

1.2.2 離子交換層析 本實(shí)驗(yàn)采用弱堿型陰離子交換劑 DEAE Sepharose Fast Flow (Vt=2.4 cm×4.2 cm)對(duì)凝膠過濾所得的脫鹽R-PE進(jìn)行分離純化．選用50 mmol/L PBS溶解各250 mL的50 mmol/L和300 mmol/L NaCl溶液進(jìn)行線性梯度洗脫,洗脫流速為30 mL/h．樣品收集與凝膠過濾方法類似,根據(jù)洗脫曲線收集離子交換洗脫峰內(nèi)的R-PEI、R-PEII組分備用．

1.2.3 疏水作用層析 根據(jù)蛋白疏水性不同,選用Butyl Sepharose 4 Fast Flow疏水層析對(duì)離子交換層析后的R-PEI和R-PEII組分進(jìn)行純化．離子交換層析收集的R-PEI和R-PEII組分加200 mmol/L (NH4)2SO4處理后分別進(jìn)行疏水層析,選用50 mmol/L PBS溶解的各200 mL的450 mmol/L和200 mmol/L (NH4)2SO4溶液進(jìn)行線性梯度洗脫,洗脫流速為24 mL/h．根據(jù)洗脫曲線收集疏水層析洗脫峰內(nèi)的R-PEI、R-PEII組分．

1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

1.3.1 Native-PAGE Native-PAGE選擇Bis-Tris-HEPES-MES中性電泳系統(tǒng),分離膠濃度8%(C 3%),pH值 7.0的Bis-Tris-HEPES-MES,濃縮膠膠濃度為4%(C 20%),pH值 5.75的Bis-Tris-MES-乙酸;正極電極液為40 mmol/L咪唑-乙酸(pH值 6.5),負(fù)極電極液為40 mmol/L Bis-Tris-Tricine(pH 6.5)．

穩(wěn)流方式電泳,在365 nm紫外光下觀察電泳條帶熒光,取膠后固定,考馬斯G-250染色,觀察記錄結(jié)果．

1.3.2 非變性等電聚焦 非變性IEF要求有穩(wěn)定的pH梯度,選擇6.5%(C3%)的聚丙烯酰胺凝膠,用3% pH值 4.0～6.5的載體兩性電解質(zhì)做緩沖劑,正極電極液為0.25 mol/L檸檬酸溶液,負(fù)極電極液為0.25 mol/L的6-氨基己酸溶液,采用300 V穩(wěn)壓電泳對(duì)R-PEI和R-PEII進(jìn)行等電聚焦電泳．

電泳條帶不再移動(dòng)時(shí)停止電泳,在365 nm紫外光下觀察電泳條帶熒光,取出膠條后固定,考馬斯G-250染色,觀察記錄結(jié)果．

1.3.3 SDS-PAGE SDS-PAGE選擇Tris-HCl電泳系統(tǒng),分離膠濃度為T=13%(C3%),分離膠緩沖液為0.375 mol/L Tris-HCl (pH值 9.1),濃縮膠濃度為T=5% (C3%),濃縮膠緩沖液為61.75 mmol/L Tris-HCl (pH值 6.8),電極緩沖液為Tris-Gly (pH值 8.3, Gly 0.192 mmol/L),內(nèi)含0.1%(W/V)SDS,用來進(jìn)行R-PEI與R-PEII的多肽組成及分子質(zhì)量分析．

純化濃縮的R-PEI與R-PEII樣品用三氯乙酸沉淀后離心清洗3～4次,干燥殘留水分后與SDS樣品溶解液溶解,60 ℃水浴保溫30 min,離心后取上清液上樣,以穩(wěn)流方式電泳．

電泳結(jié)束后先通過鋅染在365 nm紫外光下觀察SDS-PAGE凝膠板含發(fā)色團(tuán)的亞基熒光條帶,之后進(jìn)行固定,考馬斯G-250染色,觀察記錄考染結(jié)果．

1.4 光譜測定

選用紫外可見分光光度計(jì)(UV-190型,北京普析),以50 mmol/L PBS磷酸緩沖液為空白對(duì)照,測量650 nm(R-AP特征吸收峰)、618 nm(R-PC特征吸收峰)、498 nm(R-PE特征吸收峰)及280 nm處的吸光度繪制R-PE、R-PC/AP洗脫曲線,對(duì)于各階段的樣品進(jìn)行吸收光譜測定．

1.5 熒光光譜測定

將收集到的純化的R-PEI和R-PEII樣品使用熒光分光光度計(jì)(LS55)進(jìn)行Ex=498 nm熒光發(fā)射和Em=615 nm激發(fā)光譜的測定,并繪制R-PEI和R-PEII的熒光光譜．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 藻膽蛋白提取液的S-300凝膠過濾分離

由R-PE的光吸收系數(shù)K498=4.80 mL/(mg·cm)知,藻膽蛋白粗提取液(A498=7.73)中R-PE的含量為1 552 μg/mL,S-300凝膠過濾的結(jié)果如圖1所示, 498 nm洗脫曲線具有2個(gè)洗脫峰,這是由于六聚體R-PE和小于六聚體的R-藻紅蛋白(SR-PE)在波長498 nm時(shí)均具有特征吸收,618 nm為別藻藍(lán)蛋白特征吸收,650 nm為藻藍(lán)蛋白特征吸收．依據(jù)分子質(zhì)量的大小, R-PE、R-PC/AP、SR-PE依次被洗脫,R-PE的洗脫曲線與R-PC有部分重疊,按照A498洗脫曲線的完整洗脫峰,回收R-PE．從圖2吸收光譜可以看出,在618 nm處有一小峰,綜合圖1洗脫曲線可知,收集的R-PE中混雜了部分R-PC,需要進(jìn)一步分離純化．

綜上所述，超聲心動(dòng)圖可以很準(zhǔn)確、直觀以及對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，是評(píng)估尿毒癥透析患者心臟狀況比較簡便敏感、安全可靠的檢查方法，值得推廣及應(yīng)用。

2.2 R-PE組分的離子交換層析

依據(jù)多維層析原理,首先使用DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析,借助靜電荷差異對(duì)S-300所得R-PE組分進(jìn)一步分離純化．根據(jù)洗脫的先后順序,將先洗脫下來的組分命名為R-PEI,后洗脫下來的組分命名為R-PEII．

圖1 藻膽蛋白提取液的S-300凝膠過濾

Fig.1 The gel filtration of the extracted phycobiliprotein solu-tion performed by the S-300 gels

圖2 S-300后R-PE吸收光譜

Fig.2 The absorption spectra of the R-PE fraction obtained from the S-300 gel filtration

在此過程中對(duì)離子交換的洗脫條件進(jìn)行探索,依次使用了0～500 mmol/L NaCl梯度和0～400 mmol/L NaCl梯度進(jìn)行洗脫,洗脫曲線如圖3所示．圖3A中在洗脫體積為120 mL、NaCl濃度為120 mmol/L處出現(xiàn)一個(gè)洗脫峰,R-PEI和R-PEII未得到有效分離,分離效果較差;圖3B中在洗脫體積為145 mL、NaCl濃度為116 mmol/L處出現(xiàn)一個(gè)肩峰,是R-PEI,在洗脫體積175 mL、NaCl濃度為140 mmol/L出現(xiàn)一個(gè)洗脫峰為R-PEII,R-PEI和R-PEII分離效果有改進(jìn),但不理想,因此考慮將NaCl梯度變緩,選擇50～300 mmol/L的NaCl梯度洗脫對(duì)離子交換層析做進(jìn)一步優(yōu)化．

如圖4所示,更換條件后,S-300凝膠過濾后的R-PE組分經(jīng)過50～300 mmol/L NaCl梯度洗脫,依次洗脫下2個(gè)組分:R-PEI組分出峰位置在洗脫體積185 mL處,此處NaCl 濃度為142.5 mmol/L;R-PEII組分出峰位置在洗脫體積約235 mL處,此處NaCl 濃度為167.5 mmol/L．根據(jù)洗脫曲線,觀察到R-PEI和R-PEII的有效分離．

分子大小相同的六聚體R-藻紅蛋白R(shí)-PEI和R-PEII,在離子交換層析中的行為(圖4)表明:先洗脫下來的R-PEI與離子交換劑有較弱的靜電相互作用,在較低的鹽濃度即可被洗脫;而后洗脫下來的R-PEII則與離子交換劑有較強(qiáng)的靜電相互作用,需要較高的鹽濃度才可被洗脫．這一結(jié)果證明,R-PEI和R-PEII是2種在表面電荷這一結(jié)構(gòu)特性上有差異的六聚體R-藻紅蛋白,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與離子交換劑的結(jié)合強(qiáng)弱取決于其分子表面能夠與離子交換劑相互作用的靜電荷數(shù)目、分布及密度．

圖3 R-PE組分的DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析洗脫曲線

Fig.3 The elution curve of the ion exchange chromatography of the R-PE fraction on DEAE Sepharose Fast Flow

圖4 R-PE組分的DEAE Sepharose Fast Flow(NaCl 梯度50～300 mmol/L)離子交換層析洗脫曲線

Fig.4 The elution curve of the ion exchange chromatography of the R-PE fraction on DEAE Sepharose Fast Flow(NaCl gradient 50-300 mmol/L).

兩者的吸收光譜見圖5,R-PEI和R-PEII的吸收光譜并無明顯差別,R-PEI在618 nm處有一小峰,為R-PC特征吸收,根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期工作可知,在離子交換層析中R-PC的洗脫曲線與R-PEI洗脫曲線有部分重疊[14],因此收集的R-PEI含有少量的R-PC．R-PEI的蛋白純度為A565/A280=4.27,R-PEII的蛋白純度為A565/A280=4.43,分別收集R-PEI與R-PEII,進(jìn)一步探究2種R-藻紅蛋白在疏水性上的差異并純化樣品．

圖5 經(jīng)過離子交換層析所得R-PEI與R-PEII吸收光譜

Fig.5 The absorption spectra of the R-PEI and R-PEII frac-tions obtained from the ion exchange chromatography

2.3 R-PEI和R-PEII的疏水層析

離子交換后收集的R-PEI組分和R-PEII組分分別使用Butyl Sepharose 4 Fast Flow疏水層析的方法進(jìn)一步分離純化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示．

圖6 R- PEI(A)、R-PEII(B)組分的Butyl Sepharose 4 Fast Flow疏水層析洗脫曲線

Fig.6 Elution curves of the hydrophobic interaction chromatog-raphy of the R-PEI(A) fraction and R-PEII(B) fraction on Butyl Sepharose 4 Fast Flow

圖7 經(jīng)過疏水作用層析后R-PEⅠ與R-PEⅡ吸收光譜

Fig.7 The absorption spectra of the PEⅠ and PEⅡ fractions obtained from the hydrophobic interaction chromatography

2.4 R-PEI和R-PEII熒光光譜特性

圖8為在498 nm波長激發(fā)疏水層析后R-PEI和R-PEII的熒光發(fā)射光譜,從圖8可以看出R-PEI和R-PEII的熒光發(fā)射峰均位于577 nm處,二者并無明顯區(qū)別,來自于藻紅膽素．圖9為疏水層析所得的R-PEI和R-PEII在615 nm發(fā)射波長下熒光激發(fā)光譜,與吸收光譜峰型相近,R-PEI和R-PEII有3個(gè)特征峰,說明能量在色基中傳遞是良好的,所提取的是完整的R-藻紅蛋白,可用于進(jìn)一步R-藻紅蛋白的亞基分析．

圖8 疏水層析相互作用后R-PEI與R-PEII熒光發(fā)射光譜(Ex=498 nm)

Fig.8 The fluorescence emission spectra of the R-PEI and R-PEII fractions obtained from the hydrophobic interactionfigure_titlechromatography (Ex=498 nm)

圖9 疏水相互作用層析后R-PEI與R-PEII熒光激發(fā)光譜(Em=615 nm)

Fig.9 The fluorescence excitation spectra of the R-PEI and R-PEII fractions obtained from the hydrophobic interac-tion chromatography purification(Em=615 nm)

圖8和圖9表明,R-PEI和R-PEII之間熒光光譜特性沒用明顯不同,其吸收光譜(圖7)也僅在紫外光區(qū)(250～400 nm)表現(xiàn)出差異,在可見光區(qū)(400～750 nm)幾乎完全相同．這些結(jié)果表明,R-PEI和R-PEII在帶電性和疏水性上所表現(xiàn)的結(jié)構(gòu)特性差異沒有涉及或干擾其六聚體所攜帶的各發(fā)色團(tuán)微環(huán)境,R-PEI和R-PEII在250～400 nm紫外光區(qū)(圖7)光吸收的不同應(yīng)主要來自于產(chǎn)生帶電性和疏水性結(jié)構(gòu)特性差異的多態(tài)鏈．

2.5 非變性PAGE和IEF

從圖10結(jié)果可以看出R-PEI和R-PEII在365 nm光下只顯示1條條帶,考染后除了溴酚藍(lán)也僅顯示1條單一條帶,制備的R-PEI和R-PEII純度較純,沒有雜蛋白干擾．

a、c為紫外光365 nm下的熒光條帶；b、d為考染條帶

pH梯度4.0～6.5的非變性等電聚焦結(jié)果如圖11所示,經(jīng)過疏水作用層析純化的R-PEI與R-PEII均得到了單一的條帶,表明已經(jīng)獲得了較高的純度,可以用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)．通過對(duì)其等電點(diǎn)的測定,R-PEI的等電點(diǎn)在4.7,R-PEII的等電點(diǎn)在4.6, 2種藻紅蛋白的等電點(diǎn)相差0.1個(gè)單位, 表明了2種藻紅蛋白表面靜電荷存在較小的差異．

a、c為紫外光365 nm下的熒光條帶；b、d為考染條帶

Fig.11 The native isoelectric focusing of R-PEI and R-PEII fractions

2.6 SDS-PAGE

純化得到的R-PEI和R-PEII在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中并無明顯區(qū)別,因此選用SDS-PAGE分析2種R-藻紅蛋白的多肽組成,并測定各亞基或多肽的分子質(zhì)量,結(jié)果如圖12所示,1、2、3、4、5、6、7、8分別為無色連接多肽、(βγ1)、(αβ)、γ1、γ2、β、α[15]和未完全解離的R-PE．

a、b、e為紫外光365 nm下的熒光條帶；c、d、f為考染條帶

Fig.12 The SDS-PAGE of the R-PEI and R-PEII fractions from hydrophobic interaction

R-PEI和R-PEII具有相同的α、β、γ1和γ2,分子質(zhì)量分別為18.2 kU、21.5 kU、38.0 kU和33.6 kU,44.6 kU處為(αβ)復(fù)合體,52.5 kU處為(βγ1)復(fù)合體,77.2 kU處的帶是在鋅染時(shí)無熒光,而考染出現(xiàn)條帶,推測其為無色連接多肽,由于上樣蛋白濃度過高,因此存在不完全解離的R-PE,通過圖12的結(jié)果,可以推斷出在R-PEI和R-PEII在亞基組成上并無明顯差別,R-PEI和R-PEII在帶電性和疏水性等結(jié)構(gòu)特性方面所表現(xiàn)出的差異與其亞基或多肽組成并不直接相關(guān)．綜合R-PEI和R-PEII光譜數(shù)據(jù),明顯不同僅表現(xiàn)在250～400 nm 的光吸收(圖7),其在400～750 nm的可見光吸收(圖7)以及熒光光譜(圖8、圖9)幾乎完全相同．顯然,同時(shí)印證了R-PEI和R-PEII之間的結(jié)構(gòu)特性差異并沒有涉及到其所含發(fā)色團(tuán)構(gòu)象及其微環(huán)境．

3 結(jié) 論

海生紅藻多管藻富含R-PE,本實(shí)驗(yàn)室借助分子質(zhì)量差異,通過凝膠過濾對(duì)R-PE和R-PC/AP進(jìn)行有效分離．綜合本研究數(shù)據(jù)以及實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn)R-PE與R-PC/AP在離子交換中和疏水層析中均存在靜電荷的和疏水性差異[13-14，16],根據(jù)這一結(jié)果,為實(shí)現(xiàn)高含量R-藻紅蛋白與低含量R-藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白的聯(lián)合制備提供了便利．

本實(shí)驗(yàn)中分離純化的R-PEI與R-PEII在native-PAGE(圖10)和非變性IEF(圖11)中均表現(xiàn)為單一條帶,表明取得了理想的分離純化效果．層析結(jié)果表明帶有較少負(fù)電荷的R-PEI具有較強(qiáng)的疏水性,而帶有較多負(fù)電荷的R-PEII則具有相對(duì)較弱的疏水性,補(bǔ)充說明了多管藻中R-PEI和R-PEII不僅在靜電荷上存在明顯差異,在疏水性上也存在明顯的差異,根據(jù)六聚體R-PE在250～400 nm 紫外光吸收差別,推測其結(jié)構(gòu)特性差異應(yīng)與他們的多肽鏈構(gòu)象及其氨基酸殘基相關(guān),但產(chǎn)生結(jié)構(gòu)特性不同的直接原因還需通過進(jìn)一步研究予以證實(shí)．

目前雖然對(duì)于來自不同紅藻的藻紅蛋白的相關(guān)研究報(bào)道有很多,但幾乎都是針對(duì)主含量藻紅蛋白,對(duì)同一藻種中2種或2種以上、具有不同結(jié)構(gòu)特性藻紅蛋白研究卻非常少．由于在同一藻種中藻紅蛋白是結(jié)構(gòu)與光物理特性均很相似的一類蛋白,建立可從同一紅藻樣品的藻紅蛋白中有效分離純化結(jié)構(gòu)特性僅有細(xì)微差異的不同結(jié)構(gòu)類型藻紅蛋白的方法,為深化紅藻藻膽體棒結(jié)構(gòu)域中藻紅蛋白間相互作用及其有序組裝機(jī)制、藻膽體研究及紅藻藻膽體棒結(jié)構(gòu)域有序組裝等研究提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與理論依據(jù)．