彭先杰 黃婷婷 于躍 袁玉梅 肖夏 鄭連強(qiáng) 袁先鈴

摘 要：對(duì)冷吃兔的腐敗細(xì)菌進(jìn)行分離、生理生化鑒定及分子生物學(xué)鑒定。通過(guò)稀釋平板劃線法分離腐敗微生物，獲得純菌落。將分離的純菌株接種到無(wú)菌冷吃兔中富集培養(yǎng)，測(cè)定菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量，確定特定腐敗菌;通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》為參考進(jìn)行菌種初步鑒定;通過(guò)DNA提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增和凝膠電泳將菌株準(zhǔn)確鑒定到種。結(jié)果表明：引起冷吃兔腐敗變質(zhì)的特定腐敗菌為沃氏葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：冷吃兔;特定腐敗菌;生理生化鑒定;分子生物學(xué)鑒定

Abstract： Bacteria from spoiled cold spicy rabbit meat were isolated and identified by physiological， biochemical and molecular biological methods. The pure strains， obtained by the streak plate method， were re-inoculated onto sterile spicy rabbit meat and enriched. The aerobic bacterial count and total volatile basic nitrogen （TVB-N） content were measured to identify the specific spoilage organisms （SSO）. These strains were tentatively identified according to the Bergeys Manual of Determinative Bacteriology and the Manual for Systematic Identification of Common Bacteria and further identified to the species level by sequential DNA extraction， polymerase chain reaction amplification and gel electrophoresis. The SSO in cold spicy rabbit meat were Staphylococcus warneri and Bacillus subtilis.

Keywords： cold spicy rabbit meat; specific spoilage organisms; physiological and biochemical identification; molecular biological identification

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190314-057

中圖分類(lèi)號(hào)：TS251.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2019）05-0019-05

引文格式：

彭先杰， 黃婷婷， 于躍， 等. 冷吃兔特定腐敗菌的分離與鑒定[J]. 肉類(lèi)研究， 2019， 33（5）： 19-23. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190314-057.? ? http：//www.rlyj.net.cn

PENG Xianjie， HUANG Tingting， YU Yue， et al. Isolation and identification of specific spoilage organisms in cold spicy rabbit meat[J]. Meat Research， 2019， 33（5）： 19-23. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190314-057.? ? http：//www.rlyj.net.cn

兔肉具有高蛋白、高賴氨酸、高卵磷脂、高消化率、低脂肪、低膽固醇、低脲酸及低熱量的“四高四低”特性，富含維生素、硫胺素、核黃素、不飽和脂肪酸、各種礦物質(zhì)、少量的碳水化合物和脂肪等，易消化，其中多種氨基酸為人體必需氨基酸，色氨酸和賴氨酸含量均高于其他肉制品，因此具有保健、益智、美容、強(qiáng)身及養(yǎng)胃功能[1-3]。“十三五”以來(lái)，我國(guó)兔產(chǎn)業(yè)發(fā)展呈持續(xù)增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)[4]。

冷吃兔又名香辣兔，能在常溫下食用，無(wú)需加熱，故稱之為“冷吃”[5]。冷吃兔食客多、消費(fèi)量大，未來(lái)消費(fèi)市場(chǎng)潛力巨大，是市場(chǎng)發(fā)掘兔肉資源、有效利用、增值的重要途徑[6-7]。冷吃兔屬于油浸類(lèi)產(chǎn)品，脂肪、水分含量偏高，極易受微生物污染，引起產(chǎn)品腐敗[8-9]。目前，每年約有25%的肉類(lèi)產(chǎn)品在微生物作用下失去其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[10]，引起肉類(lèi)腐敗的優(yōu)勢(shì)菌群稱為特定腐敗菌（specific spoilage organisms，SSO）[11]，SSO對(duì)環(huán)境忍耐力強(qiáng)，生長(zhǎng)繁殖迅速，具有很強(qiáng)的致腐能力，存在于真空包裝低溫肉制品中的SSO主要為乳酸菌[12-14]，其次是腸桿菌[15]、熱殺索絲菌[16]。為了延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期，減少浪費(fèi)，研究冷吃兔中特定腐敗微生物影響生產(chǎn)加工的作用機(jī)理迫在眉睫。

本研究通過(guò)腐敗變質(zhì)冷吃兔的微生物分離，獲得其單菌落，篩選得到引起冷吃兔腐敗變質(zhì)的SSO，并對(duì)其進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，初步將其鑒定到屬，結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，確定SSO的種類(lèi)，為抑制冷吃兔優(yōu)勢(shì)腐敗菌生長(zhǎng)、延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期等工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兔肉、香辛料均購(gòu)于自貢市沃爾瑪超市。

冷吃兔制備：兔肉切丁、腌制、炒制、冷卻、裝袋、抽真空，制備過(guò)程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，用75%酒精消毒、火焰灼燒制備工具清除雜菌。無(wú)菌袋樣品密封保存于25 ℃無(wú)菌環(huán)境，待用。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（配備先進(jìn)的數(shù)控加工設(shè)備） 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌鍋（配備國(guó)家專(zhuān)利安全連鎖裝置/手輪式快開(kāi)門(mén)設(shè)備） 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;Kjeltec 8400全自動(dòng)凱氏定氮儀（配備專(zhuān)用計(jì)算機(jī)軟件管理及進(jìn)樣器系統(tǒng)） 福斯分析儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株腐敗特性實(shí)驗(yàn)

微生物的分離：將腐敗的冷吃兔做成稀釋梯度為10-1～10-7的菌懸液，將后5 個(gè)稀釋度的菌液接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h;挑選每個(gè)梯度培養(yǎng)基中的典型菌落，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線分離，直至得到純菌落，將分離后的菌種編號(hào)為A～J。

SSO的選定：將A～J菌株分別加入滅菌后的冷吃兔中，37 ℃培養(yǎng)24、48、72 h;通過(guò)測(cè)定菌落總數(shù)和總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量，確定菌株的致腐能力，將致腐能力較強(qiáng)的幾株菌作為SSO。

菌落總數(shù)測(cè)定：參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[17]。TVB-N含量測(cè)定：參照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[18]。

1.3.2 SSO的生理生化鑒定

參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[19]，對(duì)SSO分別進(jìn)行革蘭氏染色、生長(zhǎng)溫度與耐熱性實(shí)驗(yàn)、需鹽性和耐鹽性實(shí)驗(yàn)、需氧性實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、明膠水解實(shí)驗(yàn)、碳源利用實(shí)驗(yàn)、V-P測(cè)定實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)和硝酸鹽實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 SSO的分子生物學(xué)鑒定

用接種環(huán)沾取分離到的細(xì)菌菌株，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系中擴(kuò)增。16S rDNA基因擴(kuò)增引物上游序列：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，下游引物序列：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃、5 min，98 ℃、10 s，53 ℃、15 s，72 ℃、20 s;98、53、72 ℃共35 個(gè)循環(huán);72 ℃、5 min，4 ℃保持。PCR反應(yīng)體系為：25 μL 2×Taq-PCR MIX、2 μL 16S rDNA-F、2 μL 16S rDNA-R、2 μL Genomic DNA、19 μL ddH2O。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及膠回收，送成都肇科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)測(cè)序鑒定結(jié)果，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST軟件比對(duì)分析，找到相似菌屬（種）后，使用MAGE 5軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗菌株的分離篩選

2.1.1 腐敗菌株的分離

反復(fù)平板劃線得到10 株菌株，將其命名為A～J，菌株的菌落形態(tài)具體描述如表1所示。

2.1.2 菌落總數(shù)測(cè)定

菌落總數(shù)是判定食品受細(xì)菌污染的程度和檢測(cè)衛(wèi)生質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)[20]（國(guó)標(biāo)中菌落總數(shù)需≤105 CFU/g[21]）。由表2可知，培養(yǎng)24 h時(shí)，菌株B、D、E、F的菌落總數(shù)明顯高于其他菌株，培養(yǎng)48 h時(shí)，除菌株G、I外，其他菌株的菌落總數(shù)均超標(biāo)。

2.1.3 TVB-N含量測(cè)定

揮發(fā)性鹽基氮是動(dòng)物性食品在酶和細(xì)菌的作用下，分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨及胺類(lèi)等堿性含氮物質(zhì)[22]（國(guó)標(biāo)中TVB-N含量需≤35 mg/100 g[23]）。由表3可知，培養(yǎng)48 h時(shí)，菌株D、F的TVB-N含量均超標(biāo)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他菌株，說(shuō)明菌株D、F是引起兔肉腐敗變質(zhì)的腐敗菌，亦為目標(biāo)菌株。菌株D、F的TVB-N含量在24、48 h快速增加，72 h增加減緩，且菌株D的致腐能力略大于F。菌株D、F對(duì)冷吃兔的致腐能力強(qiáng)于其他菌株，是貯藏過(guò)程中在菌落總數(shù)和TVB-N含量2 個(gè)指標(biāo)下的目標(biāo)菌株。因此，菌株D、F是冷吃兔貯藏過(guò)程中引起其腐敗變質(zhì)的SSO。

2.2 SSO的生理生化鑒定結(jié)果

革蘭氏染色：革蘭氏染色是鑒別細(xì)菌的一種方法，根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞壁上主要成分的差異，將染色后的細(xì)菌分成兩大類(lèi)，即革蘭氏陽(yáng)性菌（紫色）與革蘭氏陰性菌（紅色）[24]。菌株D的革蘭氏染色結(jié)果呈紫色，革蘭氏陽(yáng)性菌，為球狀;菌株F呈紫色，革蘭氏陽(yáng)性菌，為直桿狀。生長(zhǎng)溫度與耐熱性：菌株D、F分別在菌體細(xì)胞有最大波長(zhǎng)（450 nm）處測(cè)定，37 ℃時(shí)生長(zhǎng)量較佳。需鹽性和耐鹽性：菌株D在菌體細(xì)胞有最大波長(zhǎng)（450 nm）處測(cè)定，鹽濃度為2%時(shí)生長(zhǎng)量較佳;菌株F在菌體細(xì)胞有最大波長(zhǎng)（450 nm）處測(cè)定，鹽濃度在5%時(shí)生長(zhǎng)量較佳。需氧性實(shí)驗(yàn)：菌株D生長(zhǎng)在半固體培養(yǎng)基的表面和底部深層無(wú)氧的地方，即菌株D的呼吸類(lèi)型為好氧兼性厭氧型;菌株F僅在半固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，即菌株F只能進(jìn)行有氧呼吸，為好氧性細(xì)菌。

接觸酶實(shí)驗(yàn)：菌株D、F與3%的過(guò)氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生氣泡，菌株D、F均含有過(guò)氧化氫酶，能分解過(guò)氧化氫。淀粉水解實(shí)驗(yàn)：菌株D不能分解淀粉，菌株F能分解淀粉。明膠水解實(shí)驗(yàn)：菌株D不能分解明膠，不產(chǎn)生明膠酶;菌株F能產(chǎn)生明膠酶，分解明膠，破壞明膠狀態(tài)。菌株F在明膠培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，再將培養(yǎng)基放在20 ℃以下，明膠不會(huì)凝固，呈液體狀態(tài)。碳源利用實(shí)驗(yàn)：菌株D、F在利用糖類(lèi)時(shí)均不產(chǎn)氣，但能利用某些特定糖類(lèi)，在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)酸。V-P實(shí)驗(yàn)：菌株D使溶液呈深紅色，菌株F使溶液呈紅色，故菌株D、F均為陽(yáng)性。菌株D、F在利用葡萄糖時(shí)，將葡萄糖分解成2 分子丙酮酸，丙酮酸在一系列反應(yīng)下形成乙酰甲基甲醇。檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)：菌株D為陰性，菌株F為陽(yáng)性。檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢驗(yàn)微生物是否能利用檸檬酸鹽并將其作為唯一碳源，結(jié)果表明：菌株D不含有檸檬酸鹽滲透酶，不能利用檸檬酸鹽;菌株F含有檸檬酸鹽滲透酶，能利用檸檬酸鈉作為唯一碳源。硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)：菌株D、F均能使溶液變紅，故均含有硝酸鹽還原酶，能把硝酸鹽還原成亞硝酸鹽、氨和氮。

分析得知：菌株D為革蘭氏陽(yáng)性菌，好氧兼性厭氧型球菌，判定為革蘭氏陽(yáng)性好氧球菌屬，無(wú)芽孢，不運(yùn)動(dòng)，接觸酶陽(yáng)性，進(jìn)一步判定為葡萄球菌屬;不產(chǎn)生淀粉酶、明膠酶，能利用葡萄糖、蔗糖和β-D-果糖產(chǎn)酸，不產(chǎn)生吲哚，不利用檸檬酸鹽，能產(chǎn)生脲酶分解尿素，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[25]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)比，初步確定為金黃色葡萄球菌的金黃色亞種或沃氏葡萄球菌。

菌株F為革蘭氏陽(yáng)性菌，好氧型，呈桿狀，有芽孢，產(chǎn)酸，初步判定為革蘭氏陽(yáng)性好氧芽孢桿菌;接觸酶陽(yáng)性，有運(yùn)動(dòng)性，水解淀粉、明膠，發(fā)酵葡萄糖、乳糖和D-甘露醇產(chǎn)酸，V-P陽(yáng)性，不產(chǎn)生吲哚，利用檸檬酸鹽，不分解尿素，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)比，初步確定為枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿菌。

2.3 SSO的分子學(xué)鑒定結(jié)果

菌株D、F的2%瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示。

由圖2可知，菌株D為沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri），菌株F為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

3 結(jié) 論

菌株D是革蘭氏陽(yáng)性球形細(xì)菌[25]，顯微鏡下排列成葡萄串狀，不生芽孢，兼性厭氧，菌落為乳白色或微黃色，不透明，無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)。經(jīng)驗(yàn)證，菌株D為沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri），是葡萄球菌屬的一種，在普通培養(yǎng)基上能大量生長(zhǎng)，在營(yíng)養(yǎng)豐富的肉制品中極易繁殖，從而引起肉制品腐敗。沃氏葡萄球菌毒性較小，致病過(guò)程緩慢;耐熱性強(qiáng)，巴氏殺菌條件下不易殺死，是一種能造成一些免疫力低下人群感染的侵襲性條件致病菌[26]，主要存在于人與動(dòng)物的皮膚及黏膜上，與人類(lèi)的動(dòng)脈栓塞和牙周炎也有一定的關(guān)系[27]。

菌株F為嗜溫、好氧、產(chǎn)芽孢的桿狀細(xì)菌，革蘭氏染色陽(yáng)性，可產(chǎn)生孢子，菌落粗糙、不透明、擴(kuò)張、污白色或微帶黃色。經(jīng)驗(yàn)證，菌株F為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），是芽孢桿菌屬的一種，現(xiàn)作為芽孢桿菌屬的模式菌種[28]，其生理特征多樣，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，能液化明膠、胨化牛乳、還原硝酸鹽、提高畜禽生產(chǎn)性能、改善腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境、調(diào)節(jié)腸道發(fā)育、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，且具有極強(qiáng)的抗逆能力[29-30]?？莶菅挎邨U菌在自然界中分布廣泛，極易分離培養(yǎng)，對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害，不污染環(huán)境[31]。

冷吃兔中的SSO為沃氏葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，其中沃氏葡萄球菌對(duì)冷吃兔的致腐能力強(qiáng)于枯草芽孢桿菌。沃氏葡萄球菌存在于動(dòng)物皮膚表面，冷吃兔中的沃氏葡萄球菌可能來(lái)源于肉兔或包裝過(guò)程中人體的接觸?？莶菅挎邨U菌是常見(jiàn)食品腐敗菌，在肉制品中生長(zhǎng)快速，會(huì)引起冷吃兔的快速腐敗變質(zhì)，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)大量損失。在冷吃兔的工業(yè)化生產(chǎn)中，可以從工藝條件、貯藏條件、包裝條件等環(huán)節(jié)遏制優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期，提高產(chǎn)品商業(yè)價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳靜霞， 余靜. 兔肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其加工業(yè)現(xiàn)狀[J]. 肉類(lèi)研究， 2008， 22（12）： 74-76.

[2] 楊紹斌， 王國(guó)澤， 曾浪， 等. 四川省兔肉產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀淺談[J]. 肉類(lèi)工業(yè)， 2017（6）： 42-45. DOI：10.3969/j.issn.1008-5467.2017.06.010.

[3] 谷子林， 陳寶江， 黃玉亭， 等. 我國(guó)兔肉消費(fèi)市場(chǎng)瓶頸分析及對(duì)策[J]. 中國(guó)養(yǎng)兔， 2014（4）： 27-30; 10. DOI：10.3969/j.issn.1005-6327.2014.04.007.

[4] 武拉平. “十三五”以來(lái)中國(guó)兔產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告（2016—2018年）[C]//

2018第8屆兔業(yè)發(fā)展大會(huì)論文集. 北京： 中國(guó)畜牧業(yè)協(xié)會(huì)， 2018： 17.

[5] 胡偉峰. 川南·自貢 冷吃兔&火邊子牛肉： 不得不吃的鹽都美食[J]. 四川黨的建設(shè)（城市版）， 2013（3）： 65-66.

[6] 史磊. 中國(guó)城市居民兔肉及兔產(chǎn)品消費(fèi)需求： 基于2017年消費(fèi)者調(diào)研數(shù)據(jù)[C]//2018第8屆兔業(yè)發(fā)展大會(huì)論文集. 北京： 中國(guó)畜牧業(yè)協(xié)會(huì)， 2018： 5.

[7] 李光輝， 鐘世榮， 馮治平. 冷吃兔復(fù)合調(diào)味料的研究[J]. 江蘇調(diào)味副食品， 2009， 26（2）： 9-11. DOI：10.3969/j.issn.1006-8481.2009.02.003.

[8] 劉學(xué)銘， 方少欽， 唐道幫， 等. 我國(guó)熟肉制品微生物安全現(xiàn)狀與控制技術(shù)[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2012（1）： 99-103. DOI：10.3969/j.issn.1673-9078.2012.01.024.

[9] 石振興， 朱仁俊. 控制肉制品微生物污染方法的研究進(jìn)展[J]. 肉類(lèi)研究， 2009， 23（7）： 30-32.

[10] GRAM L， DALGAARD P. Fish spoilage bacteria： problems and solutions[J]. Current Opinion in Biotechnology， 2002， 13（3）： 262-266. DOI：10.1016/S0958-1669（02）00309-9.

[11] HUIS IN T VELD J H. Microbial and biochemical spoilage of foods： an overview[J]. International Journal of Food Microbiology， 1996， 33（1）： 1-18. DOI：10.1016/0168-1605（96）01139-7.

[12] SAMELIS J， GEORGIADOU K G. The microbial association of Greek taverna sausage stored at 4 and 10 ℃ in air， vacuum or 100% carbon dioxide， and its spoilage potential[J]. Journal of Applied Microbiology， 2000， 88（1）： 58-68. DOI：10.1046/j.1365-2672.2000.00936.x.

[13] CHENOLL E， MACI?N M C， ELIZAQU?VEL P， et al. Lactic acid bacteria associated with vacuum-packed cooked meat product spoilage： population analysis by rDNA-based methods[J]. Journal of Applied Microbiology， 2007， 102（2）： 498-508. DOI：10.1111/j.1365-2672.2006.03081.x.

[14] BJ?RKROTH K J， KORKEALA H. Lactobacillus fructivorans spoilage of tomato ketchup[J]. Journal of Food Protection， 1997， 60（5）： 505-509. DOI：10.1002/（SICI）1097-4660（199705）69：1<130：：AID-JCTB686>3.0.CO;2-X.

[15] SAMELIS J， KAKOURI A， GEORGIADOU K G， et al. Evaluation of the extent and type of bacterial contamination at different stages of processing of cooked ham[J]. Journal of Applied Microbiology， 1998， 84（4）： 649-660. DOI：10.1046/j.1365-2672.1998.00392.x.

[16] PAPADOPOULOU O S， PANAGOU E Z， MOHAREB F R， et al. Sensory and microbiological quality assessment of beef fillets using a portable electronic nose in tandem with support vector machine analysis[J]. Food Research International， 2013， 50（1）： 241-249. DOI：10.1016/j.foodres.2012.10.020.

[17] 中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)， 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局. 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定： GB 4789.2—2016[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2016.

[18] 中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì). 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定： GB 5009.228—2016[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2016.

[19] 東秀珠， 蔡妙英. 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2001.

[20] 周賢軒， 楊波， 陳新華. 幾種分子生物學(xué)方法在菌種鑒定中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)， 2004， 14（6）： 35-38. DOI：10.3969/j.issn.1004-311X.2004.06.018.

[21] 中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)， 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局. 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品： GB 2726—2016[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2016.

[22] 上海市食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所. 肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法：?GB 5009.44—2003[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2003.

[23] 馬躍龍， 俞淑， 薛峰， 等. 調(diào)理肉制品揮發(fā)性鹽基氮的研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊）， 2012（5）： 112-113. DOI：10.3969/j.issn.1671-9646（X）.2012.05.035.

[24] WIEGEL J， QUANDT L. Determination of the gram type using the reaction between polymyxin B and lipopolysaccharides of the outer cell wall of whole bacteria[J]. Microbiology， 1982， 128（10）： 2261-2270. DOI：10.1099/00221287-128-10-2261.

[25] 布坎南R E， 吉本斯N E. 伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]. 8版. 北京： 科學(xué)出版社， 1984.

[26] 鞠慧萍， 宋白薇. 沃氏葡萄球菌VITEK鑒定分析[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息， 2010（9）： 44-47. DOI：10.3969/J.ISSN.1671-6027.2010.09.030.

[27] 楊雪蓮， 張明蘇， 蘇曉琳， 等. 隱形眼鏡所攜帶細(xì)菌種類(lèi)及對(duì)人眼的危害[J]. 世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘， 2018， 18（89）： 48; 50.

[28] LISTGARTEN M A. Microbiological composition and pattern of antibiotic resistance in subgingival microbial samples from patients with refractory periodontitis[J]. Journal of Periodontology， 64（3）：?155-161. DOI：10.1902/jop.1993.64.3.155.

[29] 劉志恒. 現(xiàn)代微生物學(xué)[J]. 北京： 科學(xué)出版社， 2008： 92-99.

[30] 楊彪， 周剛， 王倩倩， 等. 枯草芽孢桿菌在家禽生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 飼料博覽， 2014（4）： 31-34. DOI：10.3969/j.issn.1001-0084.2014.04.008.

[31] 朱玥妍， 劉姣， 杜春梅. 芽孢桿菌生物防治植物病害研究進(jìn)展[J].

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 40（34）： 16635-16638. DOI：10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.34.112.

收稿日期：2019-03-14

基金項(xiàng)目：四川省教育廳科技基金項(xiàng)目（15ZA0228）

第一作者簡(jiǎn)介：彭先杰（1995—）（ORCID： 0000-0002-1283-9482），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩こ?。E-mail： 1284665667@qq.com

*通信作者簡(jiǎn)介：袁先鈴（1979—）（ORCID： 0000-0002-3990-386X），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩こ?。E-mail： 82745373@qq.com