林城杏 黃瑤 周迎春 張鵬程 羅鑫 曾雪峰 范勁

摘 要：為解決我國傳統(tǒng)淡水魚易腐敗、魚腥味重、利用率低及附加值低等問題，對我國傳統(tǒng)淡水魚發(fā)酵制品中的乳酸菌進行分離鑒定及特性研究。結(jié)果表明：通過生理生化、耐鹽性、抑菌性、適宜生長溫度、生長曲線及pH值變化等實驗篩選出的7 株乳酸菌均適宜作為淡水魚發(fā)酵制品的發(fā)酵劑;通過16S rRNA序列分析法，確定其中2 株為戊糖片球菌，余下5 株為植物乳桿菌。

關(guān)鍵詞：淡水魚;乳酸菌;分離;發(fā)酵特性

Abstract： In order to solve the problems of traditional freshwater fish in China， such as easy spoilage， heavy fishy smell， low utilization rate and low added value， this study isolated lactic acid bacteria from different types of fermented freshwater fish in China and determined the technological properties of the isolated strains. A total of 7 isolates were obtained， and they were all found to be suitable for use as a starter culture of fermented freshwater fish according to their physiological and biochemical properties， salt tolerance， antibacterial activity， optimal growth temperature， growth curves and pH changes during their growth. Two of these were identified as Pediococcus pentosaceus， while the rest were all identified as Lactobacillus plantarum by 16S rRNA sequence analysis.

Keywords： freshwater fish; lactic acid bacteria; isolation; fermentation characteristics

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190307-049

中圖分類號：TS254.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）05-0013-06

引文格式：

林城杏， 黃瑤， 周迎春， 等. 傳統(tǒng)淡水魚發(fā)酵制品中乳酸菌的分離篩選及發(fā)酵特性[J]. 肉類研究， 2019， 33（5）： 13-18. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190307-049.? ? http：//www.rlyj.net.cn

LIN Chengxing， HUANG Yao， ZHOU Yingchun， et al. Isolation and fermentation characteristics of lactic acid bacteria from traditional fermented freshwater fish in China[J]. Meat Research， 2019， 33（5）： 13-18. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190307-049.? ? http：//www.rlyj.net.cn

目前，我國淡水魚（青魚、草魚、鰱魚、鳙魚等）的產(chǎn)量位居全球首位，但淡水魚作為加工原料卻存在水分含量高、土腥味重、肌間刺多及缺乏加工關(guān)鍵技術(shù)等問題，使得我國當前淡水魚的加工量不足淡水魚養(yǎng)殖總量的15%，與歐美日等發(fā)達國家平均淡水魚加工量占養(yǎng)殖量70%的水平相距甚遠[1]。

生物發(fā)酵技術(shù)以現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)為核心，利用微生物的代謝活動過程，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化大規(guī)模制造各種工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)品[2]。Yin Lijung等[3]將戊糖片球菌接種至鯖魚，魚肉pH值迅速降低，腸桿菌科、葡萄球菌和假單胞菌的生長受到抑制，白度、非蛋白氮和游離氨基酸含量增加，感官品質(zhì)提升。Deatraksa等[4]利用從泰國Plaa Som Fug中分離篩選的乳酸菌（Weissella）接種發(fā)酵Plaa Som Fug，檢測獲得更高的葉酸含量，明顯提高了其營養(yǎng)價值。應(yīng)用生物發(fā)酵技術(shù)不僅能改善肉類品質(zhì)，還能抑制腐敗微生物的生長，為克服阻礙淡水魚加工技術(shù)瓶頸提供了一條新的思路和方向[5]。我國傳統(tǒng)淡水全魚發(fā)酵制品在貴州、湖南、云南、廣西等少數(shù)民族（苗族、侗族等）聚居的地區(qū)具有悠久的歷史，產(chǎn)品具有色澤暗紅、酸辣適口、風味濃郁等特點[6-7]。但我國少數(shù)民族傳統(tǒng)淡水全魚發(fā)酵制品大多仍沿用手工作坊式生產(chǎn)，存在生產(chǎn)周期長、含鹽量高、質(zhì)量穩(wěn)定性差及工業(yè)化程度低的弊端[8-9]。然而，此類發(fā)酵制品中卻棲息著具有較好發(fā)酵特性、種類繁多、數(shù)量豐富的微生物，尤其是乳酸菌[10]。因此，分離篩選該類產(chǎn)品發(fā)酵過程中繁衍的具有優(yōu)良發(fā)酵特性的乳酸菌，并將篩選出的優(yōu)良乳酸菌采用模擬自然發(fā)酵的方法接種發(fā)酵，改進傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，提升該類傳統(tǒng)發(fā)酵美食品質(zhì)，最終實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，將具有一定的社會和經(jīng)濟意義。本研究選用湘西傳統(tǒng)淡水全魚發(fā)酵制品為樣品，從中篩選出7 株產(chǎn)酸快、耐鹽、耐低溫、發(fā)酵特性良好的優(yōu)勢乳酸菌，并利用16S rRNA序列分析法對其進行鑒定[11-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

湘西花垣酸魚 湖南省湘西土家族苗族自治州花垣縣;湘西鳳凰酸魚 按照傳統(tǒng)方法自制。

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、瓊脂（均為生化試劑）? ?上海博微生物科技有限公司、葡萄糖（生化試劑） 天津市永大化學(xué)試劑有限公司;精氨酸、半胱氨酸（均為生化試劑） 美國Sigma公司;溴甲酚紫（生化試劑）、乙酸鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸三銨、氫氧化鈉、醋酸鉛、CaCO3、亞硝酸鈉（均為分析純） 天津市致遠化學(xué)試劑有限公司;氯化鈉、MgSO4、MnSO4（均為分析純） 成都金山化學(xué)試劑有限公司;鹽酸（分析純） 重慶川東化工（集團）有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XSS-2電子顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司;SW-CJ-10超凈工作臺 蘇州凈化有限公司;SPX生化培養(yǎng)箱 上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司;HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠;PHS-2F pH計?上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;WFZ UV-2100紫外-可見分光光度計 龍尼柯（上海）儀器有限公司;YQX-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司;DYCP-31CN電泳儀 北京六一生物技術(shù)有限公司;9700 PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 自制鳳凰酸魚加工工藝

市售新鮮鯉魚→清水吐水除腥→背部連頭剖開→去除內(nèi)臟（去鰓）→低溫加鹽腌制1 周（食鹽添加量6%），3 d翻缸1 次→拌入炒香的小麥粉（玉米粉、大米粉、糯米粉、大豆粉）、花椒、桂皮、八角、辣椒→拌勻→余料塞滿魚肚→裝壇密封→1 個月后成品

1.3.2 乳酸菌的分離培養(yǎng)

無菌操作條件下分別準確稱量25 g花垣酸魚肉、花垣酸魚酸劑、鳳凰酸魚和鳳凰酸魚酸劑樣品，剪碎后無菌條件下分別加入到225 mL的無菌生理鹽水中，經(jīng)振蕩搖勻后梯度稀釋至所需濃度;移液管無菌移取0.1 mL樣液，采用涂布法均勻涂布至直徑為9 cm的改性MRS瓊脂培養(yǎng)基表面，經(jīng)30 ℃、48 h培養(yǎng)后每平板隨機挑取5～7 株疑似乳酸菌菌株至MRS瓊脂培養(yǎng)基反復(fù)劃線培養(yǎng)，最終獲得純菌株[14-15]。

1.3.3 乳酸菌菌株的初步篩選

通過對分離純化的每株菌株進行菌落形態(tài)觀察，進行接觸酶實驗、革蘭氏染色及葡萄糖產(chǎn)酸實驗，初步分離篩選傳統(tǒng)酸魚產(chǎn)品中的乳酸菌[16]。

1.3.4 生理生化實驗

經(jīng)過初步篩選出的疑似乳酸菌菌株，進一步通過葡萄糖產(chǎn)氣實驗、明膠液化實驗、硝酸鹽還原實驗、運動性實驗、淀粉水解實驗、產(chǎn)黏性實驗、精氨酸產(chǎn)氨實驗、產(chǎn)硫化氫實驗、耐溫性實驗及氨基酸脫羧酶實驗對其進行篩選[17]。

1.3.5 乳酸菌菌株的乳酸定性實驗

乳酸菌是利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)乳酸的一類細菌的總稱[17]，因此，采用紙層析法驗證疑似乳酸菌菌株是否產(chǎn)乳酸：首先在濾紙的下方距底邊約2～3 cm處劃一橫線，并每隔2.5～3.0 cm用鉛筆劃一“X”作樣品點樣點，并標注樣品編號，同時以2%乳酸為標樣，MRS液體培養(yǎng)基為空白對照;采用潔凈的毛細管少量多次蘸取MRS液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的乳酸菌菌株點樣，每點一次樣，均用電吹風吹干;然后將點好樣的濾紙置于層析缸中，使其飽和8 h，再添加展開劑，使其底部浸入展開劑中，層析至上行25 cm即可;取出晾干，噴灑顯色劑后觀察濾紙是否呈現(xiàn)黃色斑點，與標樣和對照組比較，觀察篩選的菌株培養(yǎng)液與標準乳酸液的保留系數(shù)（retention factor，Rf）

值是否相同[18]。

1.3.6 產(chǎn)酸速率實驗

優(yōu)良的發(fā)酵劑應(yīng)具備快速發(fā)酵產(chǎn)酸的能力，能保證發(fā)酵過程中的安全，促進風味、營養(yǎng)物質(zhì)、色澤的形成[19]。將從發(fā)酵全魚體分離篩選的不同乳酸菌菌株分別接種至MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，以無菌MRS液體培養(yǎng)基為空白對照，采用PHS-2F pH計分別測定其pH值[20]。

1.3.7 耐鹽、耐亞硝酸鹽實驗

發(fā)酵魚制品的含鹽量較高，因此制作肉制品發(fā)酵劑所選用的菌株要求具有一定的耐鹽性，而亞硝酸鹽能抑制微生物生長增殖，因此還要具備耐亞硝酸鹽的性質(zhì)[21]。將待測乳酸菌菌株分別接種至含有6 g/100 mL NaCl或150 mg/kg NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃生化培養(yǎng)箱中分別厭氧培養(yǎng)36、24 h，同時將分離的菌株分別接種至不加NaCl或不加NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)36、24 h，以無菌MRS液體培養(yǎng)基作空白對照，分別對含有分離菌株的0、6 g/100 mL NaCl及0、150 mg/kg MRS液體培養(yǎng)基在可見光600 nm波長處測定光密度（optical density，OD）值[22-23]。

1.3.8 耐酸性實驗

酸魚是一種酸性體系，魚肉發(fā)酵產(chǎn)生大量的有機酸（主要為乳酸），發(fā)酵體系pH值逐漸降低。成熟而優(yōu)良的酸魚pH值應(yīng)低于4.6，因此作為發(fā)酵劑的乳酸菌應(yīng)能耐受低pH值的乳酸環(huán)境。將上述分離篩選的乳酸菌菌株分別在MRS液體培養(yǎng)基活化24 h后，用無菌移液管吸取0.5 mL培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)置盛有10 mL磷酸鹽緩沖液的試管中，滴加5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至2.5，磷酸鹽緩沖液中乳酸菌初始濃度約為106～108 CFU/mL，37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h，以平板活菌數(shù)計數(shù)法測定存活菌數(shù)[24]，按下式計算菌株存活率。

1.3.9 抑菌性實驗

取MRS液體培養(yǎng)基活化后的乳酸菌菌株發(fā)酵液，經(jīng)離心后取上清液;以Staphylococcus aureus和Escherichia coli為指示菌，分別用無菌移液管取0.1 mL經(jīng)活化12 h的指示菌菌液，涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，并在指示菌培養(yǎng)平板上平均間隔3 cm分別打孔，每個孔內(nèi)分別滴加200 μL經(jīng)離心后的乳酸菌上清液，30 ℃培養(yǎng)24 h，記錄待測乳酸菌菌株抑菌圈的大小[25-27]。

1.3.10 最適生長溫度實驗

分別將不同的待測菌株接入到MRS液體培養(yǎng)基中，分別置于10、15、20、25、30、35、40、45 ℃條件下培養(yǎng)24 h后于600 nm波長處測定其OD600 nm值，以不接種的液體MRS培養(yǎng)基為空白對照[28]。

1.3.11 生長曲線及pH值變化實驗

分別取少量待測乳酸菌菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃活化24 h，取50 μL乳酸菌菌液，接種到5 mL MRS液體培養(yǎng)基中;采用可見分光光度計每隔4 h測定一次OD值，同時測定其pH值，連續(xù)測定36 h，然后每隔6 h測定一次，共連續(xù)測定48 h，同時做空白對照[29-31]。

1.3.12 16S rRNA序列分析

將篩選出的菌株采用試劑盒提取菌株基因組DNA，將各菌株基因組DNA進行16S rDNA基因序列聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。采用細菌通用引物27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3進行擴增。擴增體系如下：2×T5 Direct PCR Mix 25 μL、10 μmol/L

正向27F引物2 μL、10 μmol/L反向1492R引物2 μL、基因組DNA 2 μL，無菌雙蒸水補足至50 μL。PCR擴增程序如下：98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃、10 s，57 ℃、10 s，72 ℃、20 s，30 個循環(huán);72 ℃延伸3 min[32]。

擴增后，對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將成功擴增的樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將返回的測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫進行比對分析，初步鑒定菌株。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標準差。使用Origin 2016軟件作圖，使用SPSS 17.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和方差分析（P<0.05），判定數(shù)據(jù)間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

以湘西傳統(tǒng)淡水全魚發(fā)酵魚為原料，共分離出106 株疑似乳酸菌菌株，菌株菌落形態(tài)有的呈圓形或針尖狀，有的呈短桿狀，光滑整齊、形態(tài)微小、菌落直徑約1.0～2.0 mm、白色、透明或不透明。其中61 株為革蘭氏陽性球菌、6 株為革蘭氏陰性球菌、35 株為革蘭氏陽性桿菌、4 株為革蘭氏陰性桿菌。桿菌兩端平直或稍彎曲，無鞭毛，無芽孢;球菌大多為單個分布或鏈狀。

2.2 乳酸菌菌株的初步篩選結(jié)果

對分離出的96 株革蘭氏陽性菌進行發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸實驗，其中71 株細菌可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸。對分離出的上述71 株革蘭氏陽性菌進行接觸酶實驗，71 株菌均呈陰性。革蘭氏染色陽性、接觸酶陰性、可利用葡萄糖產(chǎn)酸的細菌可初步判定為乳酸菌。

2.3 生理生化實驗結(jié)果

將初步分離純化得到的71 株乳酸菌分別經(jīng)葡萄糖產(chǎn)氣實驗、耐溫性實驗及硝酸鹽還原等生理生化實驗。由表1可知，從樣品中篩選出13 株不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S，不產(chǎn)黏液、精氨酸不產(chǎn)氨、無氨基酸脫羧酶活性、耐低溫的疑似乳酸菌菌株。

2.4 乳酸定性實驗結(jié)果

由表2可知，經(jīng)生理生化實驗分離出的13 株疑似乳酸菌株發(fā)酵MRS液體培養(yǎng)基的最終產(chǎn)物均為乳酸，因此可以進一步判定13 株疑似菌株均為乳酸菌。

2.5 產(chǎn)酸速率實驗結(jié)果

發(fā)酵魚制品所需的發(fā)酵劑要求具有較快的產(chǎn)酸速率，以抑制致病菌和腐敗菌生長，為產(chǎn)品提供適宜的風味。以菌株24 h產(chǎn)酸情況作為評價菌株產(chǎn)酸速率的指標，13 株初步篩選出的乳酸菌菌株在30 ℃、24 h內(nèi)的pH值如表3所示。

由表3可知，在13 株被測菌株中，除了44號乳酸菌外，其余12 株菌株均具有較高的產(chǎn)酸速率。

2.6 耐鹽、耐亞硝酸鹽實驗結(jié)果

依據(jù)比濁法原理，以乳酸菌菌株OD600 nm值的變化為生長指標，分析乳酸菌菌株的耐鹽及耐亞硝酸鹽特性。

由表4可知，篩選出的12 株乳酸菌菌株均能耐受質(zhì)量濃度6 g/100 mL的食鹽，其中24、211、213、411號菌株的OD600 nm值偏低，耐鹽性不及113、118、145、27、28、29、220號菌株。

2.7 耐酸性實驗結(jié)果

發(fā)酵魚制品在發(fā)酵中伴隨著pH值的持續(xù)降低，因此需要所用的發(fā)酵劑具有較強的耐酸性。篩選出的12 株乳酸菌在pH 2.5的磷酸鹽緩沖液中37 ℃條件下培養(yǎng)3 h后的存活情況如表6所示。

由表6可知，不同乳酸菌菌株的耐酸能力存在差異，113號菌株在pH 2.5的酸性環(huán)境下不能存活，211、213、411號菌株存活率較低，其余菌株在pH 2.5的酸性環(huán)境下存活率高。

2.8 抑菌性實驗結(jié)果

用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌作為指示菌，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上涂布，打孔后滴加200 μL于30 ℃培養(yǎng)24 h的乳酸菌菌株上清液，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察各個菌株的抑菌圈大小。

由表7可知，24號菌株對大腸桿菌沒有抑菌性，118、120、145、27、28、29、220號菌株對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌圈，表現(xiàn)出較好的抑菌效果。

2.9 最適生長溫度實驗結(jié)果

由圖1可知，7 株篩選出的乳酸菌菌株中，145、29、220號菌株的最適生長溫度為35 ℃，118號菌株的最適生長溫度為20 ℃，而120、27、28號菌株在20～35 ℃之間的生長情況沒有明顯差別。

2.10 生長曲線及pH值變化實驗結(jié)果

生長曲線的測定：采用測定乳酸菌菌體在生長期間密度的變化，監(jiān)測菌體的活力變化，明確菌體的適宜收獲時間。菌體收獲期往往為對數(shù)生長末期或穩(wěn)定生長前期。由圖2可知，7 株篩選出的乳酸菌菌株延滯期很短，在培養(yǎng)初期就能到達對數(shù)生長期，28、29號菌株在16 h后到達穩(wěn)定生長期，生長速率明顯高于其他菌株，145號菌株也能在16 h后到達穩(wěn)定生長期，120、27號菌株能在20 h后到達穩(wěn)定生長期，118、220號菌株28 h后到達穩(wěn)定生長期，其生長速率低于其他菌株。

由圖3可知：7 株篩選出的乳酸菌菌株中118、220號菌株在培養(yǎng)初期pH值降低較為緩慢，在4 h后pH值迅速降低，隨著培養(yǎng)時間延長，pH值逐漸降低，在28 h后pH值降低緩慢，培養(yǎng)48 h后，pH值分別為4.03和4.16;其余菌株均能在培養(yǎng)初期促使MRS培養(yǎng)液pH值迅速降低，27號菌株在20 h后pH值降低趨于平緩，培養(yǎng)48 h后，pH值為3.97，145、28、29號菌株在24 h后pH值降低趨于平緩，培養(yǎng)48 h后，pH值分別為4.08、3.96和3.95，120號菌株在28 h后pH值逐漸緩慢降低，培養(yǎng)48 h后，pH值為3.69。

2.11 16S rRNA序列分析結(jié)果

通過以上一系列生理生化和發(fā)酵特性實驗，最終篩選出7 株適宜發(fā)酵的乳酸菌菌株，經(jīng)PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳分析，將送至生工生物工程（上海）股份有限公司測得7 株菌的16S rRNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知細菌基因序列進行比對。

由表8可知，118、120、145、27、220號菌株與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）序列的相似性均達99%，28、29號菌株與戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）序列的相似性達99%，即118、120、145、27、220號菌株屬于植物乳桿菌，28、29號菌株屬于戊糖片球菌。

3 結(jié) 論

本研究從傳統(tǒng)淡水全魚發(fā)酵制品中分離、純化出71 株革蘭氏陽性、接觸酶陰性、可利用葡萄糖產(chǎn)酸的疑似乳酸菌，通過對分離出的71 株疑似乳酸菌菌株進行生理生化實驗，從中篩選出13 株不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S、不產(chǎn)黏液、精氨酸不產(chǎn)氨、無氨基酸脫羧酶活性、耐低溫的疑似乳酸菌菌株;對這13 株疑似乳酸菌菌株進行紙層析乳酸定性實驗、耐鹽實驗、產(chǎn)酸速率實驗、耐酸實驗、抑菌性實驗、最適生長溫度實驗、生長曲線及pH值變化實驗，得到符合淡水全魚發(fā)酵制品發(fā)酵條件的118、120、145、27、28、29、220號7 株乳酸菌菌株;對適宜發(fā)酵的7 株乳酸菌進行種屬鑒定，結(jié)果表明，28、29號菌株為戊糖片球菌，118、120、145、27、220號菌株為植物乳桿菌。篩選出傳統(tǒng)酸魚中的有益發(fā)酵乳酸菌，并在后期作為發(fā)酵劑接種發(fā)酵酸魚，對改善酸魚工藝、提高酸魚風味和安全性將具有重要意義。

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收稿日期：2019-03-07

基金項目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31760455）;貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目（黔科合[2016]1046）

第一作者簡介：林城杏（1994—）（ORCID： 0000-0001-9926-920X），女，碩士研究生，研究方向為食品加工。E-mail： 865323261@qq.com

*通信作者簡介：范勁（1970—）（ORCID： 0000-0001-6141-909X），女，副教授，本科，研究方向為食品加工與安全。E-mail： 529715291@qq.com