孫博 宋新剛 張萌萌 張健 高習(xí)文 張立恒 尹輝 郭偉 任德強(qiáng)

摘要：本文為分子生物學(xué)方法檢測(cè)豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）外源病毒提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。用經(jīng)過驗(yàn)證的熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的24批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）中的16種外源病毒（FMDV、PCV2、CSFVW、BCoV、BVDV、BPIV-3、TGEV、PEDV、RV、PRRSV、PCV1、MRV、JEV、PPV、PRV、BHV-1），結(jié)果顯示24批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）成品均無以上16種外源病毒。

關(guān)鍵詞：豬瘟活疫苗;PCR;RT-PCR;外源病毒

中圖分類號(hào)：S852.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：2095-9737（2019）01-0001-04

Abstract：It provides experimental data for the determination of classical live swine fever vaccine（cell source） exogenous virus by molecular biology method.Detection of 16 exogenous viruses （FMDV、PCV2、CSFVW、BCoV、BVDV、BPIV-3、TGEV、PEDV、RV、PRRSV、PCV1、MRV、JEV、PPV、PRV、BHV-1） from 24 batches of live classical swine fever vaccine（cell source） produced by Harbin Yuanheng Biopharmaceuticals Co. Ltd.， the results showed that 24 batches of products did not have the above 16 exogenous viruses.

Key words：Living classical swine fever vaccine; PCR; RT-PCR; Exogenous virus

外源病毒的干擾，已經(jīng)成為疫苗質(zhì)量問題的隱形殺手，豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）的外源病毒檢測(cè)一項(xiàng)，參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2015年版第三部）要求，需要做熒光抗體檢測(cè)、致細(xì)胞病變和紅細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)[1]，以下簡(jiǎn)稱細(xì)胞培養(yǎng)法。哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司，致力于生產(chǎn)行業(yè)內(nèi)最純凈的疫苗，并始終關(guān)注檢測(cè)方法的研究，希望通過有效的檢測(cè)手段，合理、高效的保證產(chǎn)品質(zhì)量。

哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司采購了14種熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR商品化試劑盒，試劑盒分別經(jīng)過特異性、敏感性、重復(fù)性方法學(xué)驗(yàn)證[2-14]，檢驗(yàn)方法已完成驗(yàn)證。現(xiàn)用經(jīng)過驗(yàn)證的熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR商品化試劑盒檢測(cè)24批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）中的16種外源病毒（FMDV、PCV2、CSFVW、BCoV、BVDV、BPIV-3、TGEV、PEDV、RV、PRRSV、PCV1、MRV、JEV、PPV、PRV、BHV-1），以期為分子檢測(cè)方法提供臨床數(shù)據(jù)便于試驗(yàn)分析及在生產(chǎn)過程中有針對(duì)性的防止外源病毒污染。

1 材料與方法

1.1 材料

分子檢測(cè)試劑盒：豬細(xì)小病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，豬偽狂犬病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，豬圓環(huán)病毒1型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，牛皰疹病毒Ⅰ型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，口蹄疫病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，豬瘟病毒野毒株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，牛冠狀病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，牛病毒性腹瀉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，豬日本乙型腦炎病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒，豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，牛副流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒（以上材料采購自TaKaRa、Promega、青島巴特菲生物科技有限公司、北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司）。

哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司連續(xù)生產(chǎn)的24個(gè)批次豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）每批3瓶。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)系統(tǒng)FQD-96A（購自杭州博日科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取

每批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）3瓶，用生理鹽水稀釋至完全溶解后混合，根據(jù)批號(hào)依次排列順序并標(biāo)記序號(hào)。參照試劑盒說明書，進(jìn)行核酸提取。

1.2.2 擴(kuò)增

核酸提取后擴(kuò)增前將試劑盒從-20℃拿出，將試劑混勻后離心待用，每種試劑盒檢測(cè)26份樣品，分別為24批樣品、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照，每種檢測(cè)項(xiàng)目配制27份體系，提取后的核酸根據(jù)說明書要求的程序進(jìn)行擴(kuò)增，觀察曲線，并記錄CT值。PCR儀可以同時(shí)檢測(cè)96份樣品，選取三種外源病毒進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增，F(xiàn)MDV、PCV2、CSFVW為1組，BCoV、BVDV、BPIV-3為1組，PCV1、MRV、JEV為一組，TGEV、PEDV、RV、PRRSV為1組， PPV、PRV、BHV-1為1組，共進(jìn)行五次擴(kuò)增，TGEV、PEDV、RV、PRRSV組樣品數(shù)量為52個(gè)，其余每組樣品數(shù)量為78個(gè)。根據(jù)說明書在軟件上輸入不同病毒核酸的擴(kuò)增程序，經(jīng)過連續(xù)檢測(cè)直到所有外源病毒檢測(cè)項(xiàng)目完畢后進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

16種外源病毒陽性CT值符合結(jié)果判定要求，并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，陰陽性對(duì)照成立，24批豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）結(jié)果為陰性。CT值參見表1，陽性對(duì)照擴(kuò)增曲線參見圖1～圖5。

3 討論

疫苗品質(zhì)是優(yōu)良產(chǎn)品的精髓，我們從原材料、硬件設(shè)施、生產(chǎn)流程三個(gè)層面嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量，不斷苛求純凈的產(chǎn)品品質(zhì)。豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）的制備選用的原材料為細(xì)胞、胰酶、牛血清等，根據(jù)原材料動(dòng)物種屬的不同，選取豬源及牛源相關(guān)的常見外源病毒作為檢測(cè)項(xiàng)目（FMDV、PCV2、BCoV、BVDV、BPIV-3、TGEV、PEDV、RV、PCV1、MRV、JEV、PPV、PRV、BHV-1）。采用現(xiàn)代分子生物學(xué)先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)，從細(xì)胞、血清、胰酶到半成品、成品依次進(jìn)行檢測(cè)，以加強(qiáng)外源病毒的監(jiān)測(cè)及對(duì)外源病毒的來源進(jìn)行追溯。同時(shí)為了保證抗原品系純正，選取豬瘟病毒疫苗毒和野毒株熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒分別進(jìn)行疫苗毒和野毒的雙向檢測(cè)，保證疫苗無野毒污染的同時(shí)，確保疫苗品系“純正”。在生產(chǎn)流程方面，為了避免產(chǎn)品間的交叉污染，增加高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）分子生物學(xué)方法檢測(cè)外源病毒項(xiàng)。

根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版第三部外源病毒檢測(cè)法，針對(duì)豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）用非禽源細(xì)胞來源及疫苗靶動(dòng)物，選用的細(xì)胞為MDBK、Vero、PK-15[15]，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果在細(xì)胞培養(yǎng)法結(jié)果出現(xiàn)陽性時(shí)，我們可以用已建立的分子生物學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)法所使用的原材料，包括MDBK、Vero、PK-15、牛血清、胰酶的檢測(cè)，以排除實(shí)驗(yàn)過程中引入的外源病毒，保證細(xì)胞培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

細(xì)胞培養(yǎng)法和分子生物學(xué)檢測(cè)法兩者相比較，除去原材料及設(shè)備設(shè)施的不同，檢驗(yàn)周期也有很大差別。分子生物學(xué)方法可以快速、靈敏的檢出外源病毒陽性，如果分子檢測(cè)方法檢出陽性，在不能確定是否為假陽性的情況下，則需要對(duì)該樣品進(jìn)行基因測(cè)序[16]，同時(shí)該樣品接種相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞，繼代兩次后再進(jìn)行PCR檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，避免誤判。

雖然我國(guó)2015年版獸藥典未收錄分子生物學(xué)檢測(cè)方法，但在國(guó)際貿(mào)易指定試驗(yàn)中PCR方法已經(jīng)廣泛使用。如OIE（世界動(dòng)物衛(wèi)生組織） 已將檢測(cè)藍(lán)舌病病毒（BTV）、非洲豬瘟病毒（ASFV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV） 等病毒的PCR方法列為國(guó)際貿(mào)易指定試驗(yàn)方法[17]。因此細(xì)胞培養(yǎng)法只能確定是否有外源病毒污染，而分子生物學(xué)方法可以確定被污染的外源病毒的種類，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，生產(chǎn)過程中可以進(jìn)行有針對(duì)性的控制[18]，從而保證產(chǎn)品的安全性。熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR方法操作便捷、快速、直觀，可以作為細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)外源病毒的有效補(bǔ)充，鑒定疫苗的純凈性并根據(jù)污染的外源病毒種類指導(dǎo)生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中華人民共和國(guó)獸藥典[M].2015（第三部）.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2015：附錄16-18.

[2] 李永東，張常印，姜平，等.口蹄疫病毒實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2006（03）.

[3] 張福良，朱道中，宋長(zhǎng)緒.豬圓環(huán)病毒I型熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2008（01）.

[4] 曹偉偉，郭抗抗，許信剛，等.豬圓環(huán)病毒Ⅱ型TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013（01）：41（1）13-18.

[5] 趙麗，趙旭永，陳紅英，等.PPV SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012（05）.

[6] 李雪明，于紅欣，楊紅杰，等.偽狂犬病病毒gE基因熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015（04）.

[7] 許夢(mèng)怡.豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法的建立[D].揚(yáng)州大學(xué)，2016.

[8] 陽帆，劉建軍，何建凡，等.TaqMan PCR檢測(cè)乙型腦炎病毒方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008（10）.

[9] 季新成，牛國(guó)輝，員麗娟，等.牛傳染性鼻氣管炎病毒內(nèi)標(biāo)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010（06）.

[10]??? Mohit Baxi，Dorothy McRae，Shailja Baxi，et al. A one-step multiplex real-time RT-PCR for detection and typing of bovine viral diarrhea viruses[J] .Veterinary Microbiology，2006 （1） .

[11]??? Haitham M. Amer，F(xiàn)ahad N. Almajhdi，et al. Development of a SYBR Green I based real-time RT-PCR assay for detection and quantification of bovine coronavirus[J] . Molecular and Cellular Probes ， 2011 （2） .

[12]??? Toussaint J F，Rziha H J，Bauer B，et al.Effects of hypervaccination with bovine herpesvirus type 1 gE-deleted marker vaccines on the serological response and virological status of calves challenged with wild-type virus.[J] .Veterinary Record ，2004 .

[13]??? 蒲靜，賴平安，張鶴曉，等.高致病性豬藍(lán)耳病病毒TaqMan熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用[A].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2008年學(xué)術(shù)年會(huì)暨第六屆全國(guó)畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].2008.

[14]??? 張興娟.同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分豬瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹瀉病毒1型的三重?zé)晒舛縍T-PCR方法的建立[D].揚(yáng)州大學(xué)，2010.

[15]??? 吳華偉，郎洪武，陳曉春，等.《中華人民共和國(guó)獸藥典》二〇一〇年版三部非禽源細(xì)胞及其制品外源病毒檢驗(yàn)解讀[J].中國(guó)獸藥雜志，2013，47（1）：48-52.

[16]??? 尚宏華，郭建平，謝秋梅.豬瘟活疫苗外源病毒BVDV細(xì)胞培養(yǎng)與PCR檢測(cè)的比較[J].江西畜牧獸醫(yī)雜志，2014（6）：8-10.

[17]??? 世界動(dòng)物衛(wèi)生組織.陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)（哺乳動(dòng)物、禽鳥與蜜蜂）第五版[S].

[18]??? 王彩霞.幾種方法對(duì)非禽源生物制品中外源病毒檢測(cè)的研究[D].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.