唐垚，唐小曼，明建英，汪冬冬，張其圣,3*

(1.四川東坡中國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620000；2.四川理工學(xué)院，四川 自貢 643000；3.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，成都 611130)

四川泡菜是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的典型代表，因清香、嫩脆而深受人們喜愛(ài)，常作為烹飪食材和佐餐菜品[1]。四川泡菜按照加工方式可分為工業(yè)化和家庭式兩類(lèi)，其都依靠蔬菜表面附帶的微生物自然發(fā)酵而成，在貯藏階段可能積累生物胺。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

四川工業(yè)泡菜：取自四川省眉山市某知名泡菜企業(yè)，共兩份；四川家庭泡菜：取自四川省眉山市不同家庭，共兩份。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

組胺、腐胺、酪胺、尸胺等生物胺標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇等色譜純?nèi)軇嘿?gòu)于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒：購(gòu)于成都福際生物技術(shù)有限公司；2×Taq PCR Master Mix及相關(guān)引物：購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 產(chǎn)生物胺細(xì)菌篩選培養(yǎng)基(BAF)的配制

胰蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，氯化鈉5 g，葡萄糖1 g，吐溫80 0.5 mL，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCO30.1 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.04 g，溴甲酚紫0.06 g，組氨酸、酪氨酸、鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸各1 g，蒸餾水1000 mL，混勻后調(diào)節(jié)pH至 5.2，配制固體培養(yǎng)基再添加20 g瓊脂，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.4 儀器與設(shè)備

MJ-54A立式高壓滅菌鍋 上海施都凱儀器設(shè)備有限公司；L6S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、PHS-3C 酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LC-2030高效液相色譜儀 日本島津公司；T960 PCR儀 杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；JY04S-3E凝膠成像分析系統(tǒng) 北京君意電泳設(shè)備有限公司。

1.2 理化及微生物指標(biāo)測(cè)定方法

1.2.1 pH的測(cè)定

參考GB 10648—1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測(cè)定方法》。

1.2.2 總酸的測(cè)定

參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》，采用電位法測(cè)定。

1.2.3 鹽度的測(cè)定

參考GB/T 12457—2008《食品中氯化鈉的測(cè)定》。

1.2.4 菌落總數(shù)的測(cè)定

參考GB/T 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》。

1.2.5 乳酸菌的測(cè)定

參考GB/T 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》。

1.2.6 酵母的測(cè)定

參考GB/T 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》。

1.3 生物胺含量檢測(cè)

根據(jù)Frias等研究報(bào)道的方法測(cè)定樣品常見(jiàn)的8種生物胺[7]。

1.4 生物胺形成菌的篩選及鑒定

將20 g樣品加到180 mL無(wú)菌生理鹽水中，勻漿后進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)∵m當(dāng)稀釋度的菌懸液涂布于BAF固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑選BAF培養(yǎng)基上有明顯紫圈的菌落，劃線法分離純化各菌株。細(xì)菌DNA的提取參照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行，PCR擴(kuò)增體系及程序參照Haruta等的方法進(jìn)行[8]，擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用Blast軟件將菌株16S rDNA序列與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，用MEGA 5.0軟件中的Neighbor-Joining法進(jìn)行1000次步長(zhǎng)計(jì)算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 氨基酸脫羧酶基因測(cè)定

組氨酸脫羧酶hdc基因的引物及擴(kuò)增程序參考孟甜等的方法進(jìn)行[9]，酪氨酸脫羧酶tdca基因的引物及擴(kuò)增程序參考Fernández等的方法進(jìn)行[10]，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶odc基因的引物及擴(kuò)增程序參考Coton等的方法進(jìn)行[11]，賴氨酸脫羧酶cacd基因的引物及擴(kuò)增程序參考De Filippis等[12]的方法進(jìn)行。

1.6 篩選菌產(chǎn)胺能力的驗(yàn)證

參考馬秀玲等[13]的方法構(gòu)建OD值對(duì)應(yīng)菌落數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將篩選菌保持整個(gè)體系105CFU/mL的量接種于BAF液體培養(yǎng)基中，每個(gè)篩選菌3個(gè)平行，以不接菌的BAF液體培養(yǎng)基作為空白，37 ℃培養(yǎng)48 h，測(cè)其生物胺的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化及微生物指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

對(duì)四川泡菜的理化及微生物指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 四川泡菜的理化及微生物指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 1 Physicochemical and microbial indicators of Sichuan pickles

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

由表1可知，四川工業(yè)泡菜的鹽度較高，菌落總數(shù)及乳酸菌總數(shù)較低，而家庭泡菜的pH較低，酸度較高，這可能是由于家庭泡菜鹽度低，乳酸菌生長(zhǎng)不受抑制，大量產(chǎn)酸并不斷積累導(dǎo)致。

2.2 生物胺含量測(cè)定結(jié)果

四川泡菜常見(jiàn)8種生物胺的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 四川泡菜常見(jiàn)8種生物胺的測(cè)定結(jié)果Fig.1 Determination results of 8 kinds of biogenic amines in Sichuan pickles

由圖1可知，四川泡菜生物胺總含量約為697.29～1164.48 mg/kg，其中腐胺、尸胺、組胺、酪胺含量均超過(guò)100 mg/kg，為四川泡菜的主要生物胺。在四川工業(yè)泡菜中，尸胺含量最高，為(349.43±13.23) mg/kg，其次為酪胺，含量為(244.29±41.03) mg/kg。在家庭泡菜中，腐胺含量最高，為(338.2±53.07) mg/kg，其次為酪胺和組胺。本次實(shí)驗(yàn)選取的四川泡菜樣品，組胺和酪胺的含量均已超過(guò)歐洲食品安全局對(duì)食品中生物胺含量建議的100 mg/kg。研究報(bào)道，酪胺和尸胺攝入量過(guò)高，會(huì)抑制人體腸道中組胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶以及胺氧化酶的活性，導(dǎo)致組胺對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用，且酪胺和尸胺能與亞硝酸鹽形成具有致癌性的亞硝胺[14]。Sandler等研究指出攝入3 mg的苯乙胺就能造成偏頭痛[15]，當(dāng)生物胺攝入量達(dá)到1000 mg/kg時(shí)會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重危害。因此，四川泡菜的生物胺含量可能存在一定安全隱患。

2.3 產(chǎn)生物胺細(xì)菌的篩選及鑒定

四川泡菜中的生物胺除原料本身含有外，主要依靠微生物利用氨基酸脫羧形成。本研究在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加主要生物胺的前體氨基酸，添加溴甲酚紫作為指示劑，當(dāng)微生物將氨基酸脫羧形成顯堿性的生物胺時(shí)，菌落會(huì)在培養(yǎng)基上顯示紫色。依據(jù)該顯色原理，篩選產(chǎn)生物胺的細(xì)菌，分子鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 生物胺形成菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of biogenic amino-producing bacteria

從四川泡菜中分離純化共得到11株產(chǎn)生物胺的細(xì)菌，其中工業(yè)泡菜樣本中共篩選出8株，家庭泡菜中共篩選出3株。對(duì)篩選菌的16S rDNA序列進(jìn)行測(cè)定，獲得的序列在RDP數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，11株產(chǎn)生物胺細(xì)菌分別為解鳥(niǎo)氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)、阿耶波多氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)。Cosansu等研究了發(fā)酵食品中與生物胺形成相關(guān)的微生物包括芽孢桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、梭菌屬、克雷伯菌屬、埃希氏菌屬、假單胞菌屬、沙門(mén)氏菌屬等[16]。Hsien等研究了臺(tái)灣市售泡菜中與組胺形成相關(guān)的微生物包括頭狀葡萄球菌(Staphylococcuscapitis)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、光滑假絲酵母(Candidaglabrata)、褶皺假絲酵母(Candidarugosa)等[17]。

2.4 生物胺形成菌脫羧酶基因的確定

尸胺、腐胺、酪胺、組胺的形成分別與微生物中的賴氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、酪氨酸脫羧酶、組氨酸脫羧酶有關(guān)。以篩選菌的DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增氨基酸脫羧酶的相關(guān)基因，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)該微生物中是否含有脫羧酶基因，凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。

賴氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、酪氨酸脫羧酶、組氨酸脫羧酶的目標(biāo)基因條帶大小分別為220，830，700，497 bp。由圖3可知，泳道編號(hào)1，5，6有賴氨酸脫羧酶和組氨酸脫羧酶的目標(biāo)基因，對(duì)應(yīng)菌株分別為1BAF1、1BAF5、1BAF6，都為R.ornithinolytica，說(shuō)明其具有形成尸胺和組胺的能力。篩選菌中未檢測(cè)到鳥(niǎo)氨酸脫羧酶odc基因和酪氨酸脫羧酶tdca基因，四川泡菜中腐胺和酪胺含量較高，可能由發(fā)酵前、中期的微生物脫羧形成，并不斷積累導(dǎo)致。

圖3 賴氨酸脫羧酶(A)、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(B)、酪氨酸脫羧酶(C)、組氨酸脫羧酶(D)的凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Gel electrophoresis results of lysine decarboxylase(A),ornithine decarboxylase(B), tyrosine decarboxylase (C) and histidine decarboxylase (D)

2.5 篩選菌生物胺形成能力的驗(yàn)證

將11株篩選菌定量回接至BAF液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后測(cè)定生物胺的含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 篩選菌生物胺形成能力測(cè)定結(jié)果Fig.4 Determination results of biogenic amine formation ability of screening bacteria

由圖4可知，菌株1BAF1、1BAF5、1BAF6形成了大量的尸胺和組胺，這3株菌都為R.ornithinolytica，結(jié)果與2.4一致。其中，菌株1BAF1和1BAF5形成尸胺的能力較強(qiáng)，在BAF液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，分別形成(766.67±2.17) mg/L和(754.90±29.07) mg/L的尸胺，四川工業(yè)泡菜中尸胺含量較高可能與R.ornithinolytica有關(guān)，而菌株1BAF5形成尸胺能力較弱，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定尸胺含量為(141.22±52.79) mg/L，說(shuō)明不同菌株的尸胺形成能力強(qiáng)弱存在差異。菌株1BAF1、1BAF5、1BAF6在BAF液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，含量在308.98～378.89 mg/L之間，說(shuō)明其產(chǎn)組胺能力差別不大。

3 結(jié)論

四川工業(yè)泡菜和家庭泡菜的理化特征和微生物數(shù)量存在差異，腐胺、尸胺、組胺、酪胺為主要的生物胺，且在四川工業(yè)泡菜中，尸胺含量最高。從四川泡菜中篩選出11株產(chǎn)生物胺的細(xì)菌，通過(guò)檢測(cè)氨基酸脫羧酶基因及回接產(chǎn)胺實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了R.ornithinolytica具有形成尸胺和組胺的能力，且四川工業(yè)泡菜中尸胺含量較高可能與R.ornithinolytica有關(guān)。本研究可為四川泡菜生物胺含量的調(diào)控提供參考。