高鵬巖，劉瑞山，張曉娟，陸震鳴，史勁松，許正宏，李崎

(1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3.福建綠泉食品有限公司，福建 漳州 363200)

蘋果是我國主要的水果產(chǎn)品之一，除鮮食外，主要用于加工生產(chǎn)濃縮蘋果汁[1]。蘋果醋是近年興起的一種健康飲品，是以新鮮蘋果或蘋果汁為原料通過酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵而成。這一發(fā)酵產(chǎn)品既改善了蘋果原料的風味品質(zhì)，還具有促進食欲、消食化滯等功能。蘋果醋在風味和健康功能兩方面受到市場和消費者的普遍認同，因此也是提高蘋果附加值的可行深加工方式[2]。

蘋果醋中有機酸除乙酸外，還含有蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等不揮發(fā)酸，這些不揮發(fā)酸可以降低乙酸的刺激性，使酸味更柔和、醇厚[3-5]。氨基酸是蘋果醋中重要的營養(yǎng)與呈味物質(zhì)，不僅具有特殊的味感，包含酸、甜、苦、鮮、澀[6,7]，還可以生成香味物質(zhì)貢獻呈香能力[8]。有機酸、游離氨基酸和揮發(fā)性物質(zhì)對蘋果醋獨特風味的形成具有重要意義。

不同的微生物發(fā)酵得到的食品、飲品會存在不同的風味特征。陳佳楠等[9]研究了4種不同釀酒酵母對黃酒揮發(fā)性物質(zhì)形成的影響，結(jié)果表明不同菌株釀造的黃酒樣品揮發(fā)性物質(zhì)存在明顯差別。在發(fā)酵乳制品中，不同菌種也會影響酸奶、奶酪等發(fā)酵食品的口感、品質(zhì)和風味特征[10]。因此，本文以濃縮蘋果汁為原料，通過分析蘋果醋發(fā)酵過程中有機酸、氨基酸和風味物質(zhì)組成變化，解析不同釀酒酵母參與發(fā)酵的蘋果酒和蘋果醋的風味差異。通過分析這些感官差異背后的物質(zhì)基礎(chǔ)，追蹤微生物的代謝行為差異，可以為產(chǎn)品開發(fā)和評價提供重要的基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與菌種

濃縮蘋果汁(70 °Brix)：來自福建綠泉食品有限公司；釀酒酵母JNU-S2、釀酒酵母JNU-R6、巴氏醋酸菌：本實驗室保藏。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；Agilent 1100氨基酸分析儀 美國安捷倫科技有限公司；Trace1310-ISQ LT氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 蘋果醋發(fā)酵工藝

1.2.1 工藝流程

濃縮蘋果汁→調(diào)整糖度→滅菌→酒精發(fā)酵→過濾→醋酸發(fā)酵→過濾→發(fā)酵成品→參數(shù)測定。

1.2.2 步驟

調(diào)整糖度：將濃縮蘋果汁的糖度調(diào)整為15 °Brix。

酒精發(fā)酵：釀酒酵母JNU-S2和釀酒酵母JNU-R6分別以3%的接種量接入蘋果汁中，于30 ℃靜置發(fā)酵。每隔24 h測定酒精度和殘?zhí)堑淖兓?/p>

醋酸發(fā)酵：初始酒精度為6%左右，接種量為4%，發(fā)酵溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，每隔24 h測定其總酸變化。

1.3 測定方法

1.3.1 還原糖的測定

參考GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》中的直接滴定法。

1.3.2 乙醇的測定

參考GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》中的酒精計法。

1.3.3 總酸的測定

參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法。

1.3.4 有機酸的測定

參考GB/T 18623—2011《地理標志產(chǎn)品鎮(zhèn)江香醋》中有機酸的檢測。

1.3.5 游離氨基酸分析

參考QB/T 4356—2012《黃酒中游離氨基酸的測定 高效液相色譜法》。

1.3.6 揮發(fā)性物質(zhì)分析

參考魏晉梅等[11]的揮發(fā)性風味物質(zhì)測定方法。

1.3.7 風味物質(zhì)差異分析

基于R語言的DESeq2包對風味物質(zhì)數(shù)據(jù)進行差異分析，以log2(Fold Change)為橫坐標，以顯著性P值的負對數(shù)-log10(p-value)為縱坐標繪制火山圖。利用一定的篩選條件(Fold Change>2，顯著性P值<0.05)，即可篩選出顯著性差異的關(guān)鍵風味物質(zhì)，進行差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩株釀酒酵母分別參與的蘋果醋發(fā)酵過程

圖1 15 °Brix的蘋果汁在兩株釀酒酵母參與下發(fā)酵果酒和果醋的過程曲線Fig.1 Process curve of fruit wine and fruit vinegar fermented by apple juice of 15 °Brix with the participation of two strains of Saccharomyces cerevisiae

兩株釀酒酵母在15 °Brix蘋果汁中都可以發(fā)酵完全，最終酒精度均為6.1%左右(見圖1)。釀酒酵母JNU-R6的糖耗速率和產(chǎn)乙醇速率略高于JNU-S2。發(fā)酵第2天兩株菌的差異最顯著，釀酒酵母JNU-R6對糖的轉(zhuǎn)化力更強。上述不同酵母發(fā)酵得到的蘋果酒在接種醋酸菌后進行醋酸發(fā)酵，不同的果酒在醋酸發(fā)酵階段總酸變化趨勢基本相同。

通過初步的感官評價，兩株釀酒酵母參與的蘋果醋口味都比較純正，具有典型的蘋果醋風味特征。同時兩種果醋也具有明顯的感官區(qū)別，蘋果醋R酸感強烈，風味濃郁突出；而蘋果醋S的風味相對清淡柔和，蘋果的果香風味更顯著。這一結(jié)果說明雖然發(fā)酵過程曲線非常相似，且總酸基本相同，但是具體的代謝物成分和比例存在一定差異。這是由兩株釀酒酵母的代謝特性決定的，因此本文重點關(guān)注決定這種感官差異的物質(zhì)基礎(chǔ)，從有機酸、游離氨基酸、揮發(fā)性風味物質(zhì)方面做細化分析。

2.2 蘋果醋發(fā)酵各階段有機酸組成

本文主要對蘋果醋發(fā)酵過程中的10種有機酸進行了分析，其中乙酸是醋酸發(fā)酵階段的主要產(chǎn)物，蘋果醋R和蘋果醋S中的乙酸含量分別為52.5 g/L和49.2 g/L，蘋果醋S含有更少的乙酸，是其口感相對淡爽的原因之一。此外，其他幾種含量相對較少的有機酸對口感也有顯著的貢獻，結(jié)果見圖2。蘋果汁中含量最高的為蘋果酸和酒石酸，分別占有機酸總量的81.2%和9.1%。蘋果酒R中蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸含量較高，分別為49.6%、13.4%、12%、9.2%；蘋果酒S中蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸含量分別為55.28%、8.81%、26.04%，沒有檢測到乳酸；蘋果醋R中蘋果酸和檸檬酸含量較高，其中蘋果酸呈味緩慢，保留時間較長，而檸檬酸酸味圓潤，但后味持續(xù)較短。因此也是蘋果醋R風味濃郁、層次豐富的重要原因之一。

圖2 蘋果醋發(fā)酵各階段主要的有機酸組成Fig.2 Composition of major organic acids in different fermentation stages of apple vinegar

2.3 蘋果醋發(fā)酵各階段游離氨基酸的組成

表1 蘋果醋發(fā)酵各階段游離氨基酸的變化Table 1 Changes of free amino acids in various fermentation stages of apple vinegar

許多氨基酸都有一定的呈味作用[12,13]，如甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸具有甜味，天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸等具有鮮味，因此氨基酸對蘋果醋的整體風味有顯著影響。由表1可知，蘋果汁中氨基酸含量豐富，主要有天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸。經(jīng)過酒精發(fā)酵后，由于可以在生物合成中被酵母菌優(yōu)先利用，天冬氨酸和谷氨酸顯著減少[14]。果酒R和果酒S中總氨基酸含量較原果分別減少了76.01%和83.01%，同時果酒中亮氨酸、賴氨酸有所增加，可能來自酵母發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物或發(fā)酵完畢后的酵母細胞自溶。果醋中總氨基酸含量約為蘋果酒的2倍，其中苯丙氨酸的含量分別提高了10倍(R)和果醋8倍(S)，纈氨酸分別提高了3倍(R)和4倍(S)。此外果醋R比S中積累更多的蘇氨酸和亮氨酸，構(gòu)成兩者不同的風味差異。

果酒中的必需氨基酸含量較原果汁有所降低，但經(jīng)過醋酸發(fā)酵之后，又得到顯著積累(見圖3)。果醋R中的必需氨基酸為原果汁中的3.8倍，果醋S中的必需氨基酸為原果汁中的1.6倍。釀酒酵母JNU-R6參與發(fā)酵得到的蘋果醋氨基酸積累更多，這也是果醋R風味更加濃郁的原因之一。

圖3 不同發(fā)酵階段果醋中必需氨基酸的組成Fig.3 Composition of essential amino acids in apple vinegar at different fermentation stages

2.4 蘋果醋發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化以及關(guān)鍵差異物質(zhì)分析

圖4 蘋果醋發(fā)酵過程中風味物質(zhì)的變化Fig.4 Changes of flavor substances in apple vinegar fermentation process

揮發(fā)性風味物質(zhì)對蘋果醋的品質(zhì)和感官特征都有重要作用。蘋果醋在整個發(fā)酵過程中共檢測到111種揮發(fā)性風味物質(zhì)，檢測到的部分揮發(fā)性化合物在蘋果醋發(fā)酵過程中的變化規(guī)律見圖4。蘋果汁中含量較高的風味物質(zhì)為糠醛、棕櫚酸乙酯和2，4-二叔丁基苯酚，分別占總含量的15.2%、9.7%、7.8%。棕櫚酸乙酯是重要的天然產(chǎn)物，呈微弱蠟香和奶油香氣[15]，而糠醛和2，4-二叔丁基苯酚可能產(chǎn)生于濃縮蘋果汁的加工過程[16]。

蘋果汁經(jīng)酒精發(fā)酵后高級醇和酯類化合物含量和種類更加豐富，果酒R中酯類物質(zhì)增加到36種，果酒S增加到17種，發(fā)酵過程生成的多種酸類和醇類為酯類的形成提供了豐富的前體。醋酸發(fā)酵后，風味物質(zhì)的種類和含量有所減少，果醋R和果醋S中酯類物質(zhì)分別減少到17種和14種。在醋酸發(fā)酵階段，酯類物質(zhì)被進一步水解或轉(zhuǎn)化是一部分原因，同時發(fā)酵過程中攪拌和通風也造成了揮發(fā)性風味物質(zhì)的損失。蘋果醋中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸異丁酯是含量最高的酯類物質(zhì)。

圖5 蘋果醋R和蘋果醋S風味物質(zhì)差異分析Fig.5 Analysis on the differences of flavor substances between apple vinegar R and apple vinegar S

對兩種果醋進行了揮發(fā)性風味物質(zhì)的差異分析(見圖5)，兩種蘋果醋的主體風味成分有乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、異戊醇、苯乙醇，其中乙酸異戊酯和乙酸異丁酯具有香蕉和梨水果香味，乙酸苯乙酯為甜的玫瑰花香味，異戊醇有蘋果白蘭地香氣和辛辣味。苯乙醇具有柔和持久的玫瑰香和蜜香，是果醋中重要的芳香化合物[17]。根據(jù)差異分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘋果醋S比蘋果醋R顯著增加的主要風味物質(zhì)有乙酸乙酯、異丁醇等，其中乙酸乙酯含量提高了2倍；顯著減少的主要風味物質(zhì)有乙酸異戊酯、辛酸、葵酸、己酸。其他主要的風味物質(zhì)如乙酸、異戊醇、苯乙醇均無顯著差異。蘋果醋S較蘋果醋R含有更多的乙酸乙酯和較少的辛酸、葵酸，這也是果醋S口感較柔和的原因。

3 結(jié)論

本文研究了以濃縮蘋果汁為原料，由兩種酵母菌種發(fā)酵成蘋果酒，再經(jīng)巴氏醋酸菌發(fā)酵成蘋果醋的過程。通過對果醋的風味特征進行初步評價，確證了由兩株釀酒酵母導致的產(chǎn)品感官特征的差異。

果醋中除了乙酸為主體代謝產(chǎn)物以外，大部分果汁中的蘋果酸得到保留，同時也積累了少量檸檬酸，增加了果醋感官上的層次感。醋酸發(fā)酵后，果醋中的必需氨基酸含量較原果汁提高了2～4倍，但損失了大量揮發(fā)性風味物質(zhì)。果醋R含有較多的乙酸、蘋果酸、檸檬酸，因此酸味更加強烈突出，余味持久，并且含有更多的必需氨基酸，增加了入口的豐富度以及營養(yǎng)價值。而果醋S中的風味物質(zhì)含量相對較少，各物質(zhì)組成也較平衡協(xié)調(diào)，決定了果醋S風味純凈、柔和淡雅的風味特征。本文研究了乙醇和乙酸這兩種主要的代謝產(chǎn)物以外，其他含量相對較少的物質(zhì)對產(chǎn)品風味的影響，細化了不同的微生物通過其獨特的代謝行為對發(fā)酵產(chǎn)物中各風味物質(zhì)積累的偏好性。結(jié)果表明在果酒發(fā)酵階段由于不同菌種造成的代謝物差異，不僅會帶入到果醋終產(chǎn)品中，也會對果醋發(fā)酵階段醋酸菌的代謝產(chǎn)生擾動。本文的研究結(jié)果，可以拓展到其他種類原料的液態(tài)發(fā)酵醋飲品的開發(fā)和品質(zhì)分析中。