高振杰，郭錫欽

（1.北京大學(xué)附屬中學(xué)，北京 100081；2.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 臨安 311300）

大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌作為畜禽養(yǎng)殖中常見(jiàn)的致病菌，發(fā)病率較高，且能通過(guò)各種方式造成食品污染。其中大腸桿菌主要引起仔豬黃白痢，沙門氏菌引起仔豬副傷寒、雞白痢和禽傷寒等[1-2]。金黃色葡萄球菌常引起仔豬滲出性皮炎、牛羊乳房炎和子宮內(nèi)膜炎、犬貓鼻炎以及雞水腫病等多種動(dòng)物疾病[3-5]。為預(yù)防和治療這3種細(xì)菌，養(yǎng)殖過(guò)程中大量不合理使用抗生素產(chǎn)生了許多耐藥菌株，已威脅到人類的健康，故尋找可抑制這些細(xì)菌生長(zhǎng)的綠色飼料添加劑具有重要意義。

α-單月桂酸甘油酯（GML），又名十二酸單甘油酯，是可由月桂酸和甘油直接酯化得到的中鏈脂肪酸，也是一種親酯性非離子型表面活性劑。研究表明，GML 具有抑菌、抗病毒作用，且被美國(guó)FDA（食品與藥物管理局）認(rèn)定為GRAS（一般公認(rèn)安全）類食品添加劑。我國(guó)衛(wèi)生部也于2005 年4月批準(zhǔn)GML用于各類食品[6-8]。

研究表明，GML 可提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能以及免疫機(jī)能[9-10]。但是關(guān)于其抑制腸道致病菌方面的報(bào)道并不多。本試驗(yàn)選取了大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌這3 種畜禽養(yǎng)殖中常見(jiàn)致病菌，通過(guò)牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)和搖瓶實(shí)驗(yàn)，探究一定濃度的GML 對(duì)這3 種菌的抑菌效果，為進(jìn)一步合理利用GML提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品與菌種

GML 原料購(gòu)自浙江惠嘉生物科技股份有限公司；大腸桿菌K88由浙江大學(xué)惠贈(zèng)；雞白痢沙門氏菌（CVCC1791）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

GML溶液的配制：準(zhǔn)確稱取GML樣品2 g，用95%乙醇溶解成澄清溶液，定容至50 mL 容量瓶中，終濃度為40 mg·mL-1。

LB 液體培養(yǎng)基的配制：準(zhǔn)確稱取胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，用ddH2O 定容至950 mL，用HCL 和NaOH 調(diào) 節(jié)pH 至7.0，再 用ddH2O定容至1 L，121 ℃滅菌30 min備用。

LB 固體培養(yǎng)基的配制：準(zhǔn)確稱取并加入LB 液體培養(yǎng)基的原料，再添加15 g 瓊脂粉，調(diào)pH 至7.0，定容滅菌備用。

菌種活化及菌液制備：分別將大腸桿菌k88、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌接種在LB 固體培養(yǎng)基上，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，挑取活化的細(xì)菌菌落，LB 固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌水將菌落洗脫，充分振蕩，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌數(shù)量，再制成1×106～1×107cfu·mL-1的懸浮液備用。

1.2.2 不同濃度的GML 對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌實(shí)驗(yàn)方法

將40 mg·mL-1濃度的GML 溶液依次配比稀釋得到濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.0195 mg·mL-1的樣本液，并以95%乙醇溶液作為陰性對(duì)照。

牛津杯雙層平板擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)：LB 固體培養(yǎng)基于121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至適當(dāng)?shù)臏囟?，無(wú)菌條件下向已滅菌的培養(yǎng)皿（90 mm）加入LB 培養(yǎng)基15～20 mL進(jìn)行封底，待第1層培養(yǎng)基充分冷卻凝固后，分別用滅菌移液器吸取已調(diào)好的供試菌0.1 mL（濃度106cfu·mL-1），將菌液接種至約45 ℃的LB 固體培養(yǎng)基，搖勻后迅速用移液管移取5～7 mL 含菌液的培養(yǎng)基至已凝固LB 培養(yǎng)基表面，并使菌液分布均勻。待第二層培養(yǎng)基完全冷卻凝固后，用無(wú)菌鑷子夾取已滅菌的牛津杯（φ6×8×10 mm）置于LB 培養(yǎng)基表面，加入適當(dāng)量的樣品溶液，使液面高度與杯口持平。培養(yǎng)皿蓋上陶瓷蓋后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20 h。

使用菌落分析儀查看并測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)皿中抑菌圈直徑的大小，根據(jù)抑菌圈直徑的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行敏感程度判定：抑菌圈直徑＞20 mm 為極度敏感，直徑15～20 mm為高度敏感；直徑10～15 mm為中度敏感；直徑7～9 mm 為低度敏感；抑菌圈直徑＜7 mm為不敏感；直徑越大，抑菌能力越強(qiáng)[11]。

1.2.3 GML 處理不同時(shí)間對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)抑制的試驗(yàn)方法

配制LB 液體培養(yǎng)基500 mL，分裝至100 mL 錐形瓶中，每瓶50 mL，共分裝9瓶，滅菌冷卻備用。

接種之前，在超凈臺(tái)將培養(yǎng)瓶分為3 組，每組3個(gè)重復(fù)，組1為空白對(duì)照組，不添加任何菌與GML；組2為試驗(yàn)組，接種適宜濃度（1×106cfu·mL-1）的菌液并添加GML 原料（終濃度為1 mg·mL-1）；組3 為對(duì)照組，只接菌不添加GML。加樣后用錫紙封蓋以防止污染。37 ℃，180 r·min-1于搖床上震蕩搖瓶，在培養(yǎng)時(shí)間為0、4、8、12、24 h 時(shí)取培養(yǎng)液1 mL，于96 孔板加樣200 μL·孔-1，每份樣3 個(gè)重復(fù)，采用酶標(biāo)儀在600 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)OD 值。OD值越高，說(shuō)明培養(yǎng)液越渾濁，菌的數(shù)量越多。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 進(jìn)行單因素方差（One-Way ANOVA）分析，使用LDS 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度GML 對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的影響

不同濃度GML 對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用見(jiàn)附表。

由附表可知，大腸桿菌對(duì)GML濃度≤40 mg·mL-1低度敏感，抑菌圈直徑與溶劑對(duì)照組相比無(wú)顯著差異；沙門氏菌對(duì)GML 濃度＜0.156 mg·mL-1低度敏感，對(duì)GML 濃度≥0.156 mg·mL-1中度敏感，GML濃度≥0.313 mg·mL-1抑菌圈直徑顯著＞0.156 mg·mL-1及以及下濃度GML 的抑菌圈直徑；金黃色葡萄球菌對(duì)GML 濃度≤0.039 mg·mL-1低度敏感，GML濃度≥0.078 mg·mL-1中度敏感，GML 濃度≥2.5 mg·mL-1高度敏感。

附表 不同濃度GML對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用

2.2 GML處理時(shí)間對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制效果

GML 處理不同時(shí)間對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用見(jiàn)圖1。

圖1 GML處理不同時(shí)間對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用

由圖1 可知，GML 對(duì)大腸桿菌無(wú)顯著抑菌作用，CML 組和對(duì)照組培養(yǎng)液OD 值均隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，在12 h后開(kāi)始保持平穩(wěn)。

2.3 GML 處理不同時(shí)間對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)的抑制效果

GML 處理不同時(shí)間對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)的抑制效果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，沙門氏菌組對(duì)照組和GML組培養(yǎng)液OD 值在培養(yǎng)8 h 前皆穩(wěn)定上升，在8 h 后兩者的OD 值出現(xiàn)一定差異，12～48 h 時(shí)兩者OD 值差異顯著（P＜0.05），36～48 h 時(shí)OD 值趨于平緩。結(jié)果表明，GML 對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)有抑制效果，且抑制效果從12 h開(kāi)始較為明顯。

圖2 GML處理不同時(shí)間對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)的抑制作用

2.4 GML 處理不同時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制效果

GML 處理不同時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制作用見(jiàn)圖3。

由圖3 可知，金黃色葡萄球菌對(duì)照組的培養(yǎng)液OD 值在8 h 之前快速升高，在8 h 之后保持平穩(wěn)增長(zhǎng)；GML 組培養(yǎng)液OD 值在12 h 前無(wú)明顯升高，在12 h之后平緩升高，從4 h開(kāi)始兩組間OD值表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，從4 h 開(kāi)始，GML對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。

圖3 GML處理不同時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制作用

3 討 論

α-單月桂酸甘油酯作為中鏈脂肪酸，在食品中應(yīng)用廣泛。研究表明，月桂酸及其單甘油酯抑菌效果優(yōu)于同類脂肪酸及其甘油酯[12]。其抑菌作用可通過(guò)與細(xì)菌細(xì)胞壁或生物膜結(jié)合影響其代謝，或是抑制芽孢類細(xì)菌的芽孢生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)[13-14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，GML 對(duì)屬于革蘭氏陽(yáng)性菌的金黃色葡萄球菌有顯著抑制效果；而對(duì)革蘭氏陰性菌類的沙門氏菌有較強(qiáng)抑菌作用，但對(duì)大腸桿菌抑制效果相對(duì)偏弱，與前人研究結(jié)果基本一致[14]。試驗(yàn)結(jié)果表明，GML 在體外對(duì)大腸桿菌抑制效果較差，可能與大腸桿菌種類或與試驗(yàn)所用GML 濃度有關(guān)；GML 在金黃色葡萄球菌增殖前對(duì)其產(chǎn)生抑制作用，而對(duì)沙門氏菌的抑菌效果在12 h 后開(kāi)始呈現(xiàn)差異，此現(xiàn)象或許與GML 跨越細(xì)胞膜的難易程度有關(guān)。由于芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁多以肽聚糖和包括磷壁酸的酸性多糖構(gòu)成，利于GML穿越細(xì)胞膜，通過(guò)破壞其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，影響膜代謝等方式發(fā)揮抑菌效果，因此其在細(xì)菌生長(zhǎng)之初就能發(fā)揮抑制效果。而針對(duì)革蘭氏陰性菌，GML的抑菌效率相對(duì)較低，這可能與其膜表面的LPS脂多糖層有關(guān)。研究表明，革蘭氏陰性菌如變形桿菌和大腸桿菌質(zhì)膜的LPS被破壞后，GML對(duì)其抑制效率會(huì)顯著提升，因此實(shí)際應(yīng)用中常把GML 與LPS 干擾劑如EDTA 等制成凝膠混用以達(dá)到更好的抑菌效果[15]。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，GML 濃度≤40 mg·mL-1對(duì)大腸桿菌無(wú)顯著抑菌作用，≥0.156 mg·mL-1對(duì)沙門氏菌有抑制作用，≥0.078 mg·mL-1對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用。1 mg·mL-1對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用在培養(yǎng)4 h 出現(xiàn)，對(duì)沙門氏菌的抑制作用在培養(yǎng)12 h 出現(xiàn)，對(duì)大腸桿菌在培養(yǎng)48 h 內(nèi)無(wú)抑制作用。綜上所述，GML 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，沙門氏菌次之，大腸桿菌幾乎無(wú)作用。