黃思遠(yuǎn) 孫寧陽(yáng) 石晏丞

摘要：為評(píng)價(jià)DNA條形碼候選序列對(duì)藏藥波棱瓜屬植物的鑒定作用，探討波棱瓜屬植物鑒定新方法，本研究采用不同產(chǎn)地、不同海拔波棱瓜植物的ITS2、PsbA-trnH、rbcL、matK通用引物對(duì)110份樣品進(jìn)行DNA提取、PCR 擴(kuò)增和測(cè)序，比較4條DNA序列擴(kuò)增效率和測(cè)序成功率;分析種內(nèi)和種間變異;通過(guò)Barcoding gap 分析，構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹，評(píng)價(jià)各序列對(duì)西藏自治區(qū)、云南省、四川省不同海拔波棱瓜藥材的辨別能力。研究結(jié)果表明，ITS2序列在所研究的波棱瓜屬藥用植物中的擴(kuò)增效率和測(cè)序成功率均為100%，其種內(nèi)種間變異、Barcoding gap與其他DNA條形碼候選序列相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，以ITS2序列作為DNA條形碼，可對(duì)波棱瓜進(jìn)行準(zhǔn)確、快速識(shí)別和鑒定，準(zhǔn)確地弄清楚不同地區(qū)不同海拔所生長(zhǎng)的波棱瓜之間的進(jìn)化關(guān)系，為該藥用植物的質(zhì)量控制、安全用藥及資源合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：波棱瓜屬;DNA條形碼;ITS2;matK;rbcL;PsbA-trnH

中圖分類號(hào)：S567.21+9.01?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0066-05

波棱瓜作為傳統(tǒng)的藏藥材，其用藥部位為其干燥種子。它的藥理作用在藏藥學(xué)著作《月王藥診》中被著述，波棱瓜子味苦、性寒，可和纖毛婆婆納、藏茵陳、止瀉木按一定劑量進(jìn)行配伍煎湯，藏醫(yī)主要用其治療赤巴炎癥;此外波棱瓜子與玉石等配伍主要治療各種肝病[1]。波棱瓜子木脂素部位及其單體常用于治療黃疸、肝炎、消化不良及肝膽疾病。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，波棱瓜子的藥理作用主要有抗肝損傷[2]、抗肝炎[3]等。

DNA條形碼技術(shù)通過(guò)測(cè)定植物DNA序列進(jìn)行比較來(lái)反映其遺傳差異，通過(guò)建立生物DNA 條形碼系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化的物種鑒定[4-5]。目前，研究者們已經(jīng)測(cè)定了10 多條植物候選DNA條形碼序列[6]，并在不同的類群中對(duì)各條形碼的鑒定能力進(jìn)行了考察。ITS2序列中含有豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，并且該序列在植物中廣泛存在，因此可以應(yīng)用于物種的鑒定，對(duì)植物有較高的鑒別能力[7-8]?？梢酝ㄟ^(guò)ITS2序列來(lái)區(qū)分波棱瓜植物的產(chǎn)地，進(jìn)行快速準(zhǔn)確識(shí)別和鑒定，對(duì)研究波棱瓜的分布有指導(dǎo)作用，對(duì)其遺傳育種研究、種質(zhì)資源的生乳研究以及資源保護(hù)和全利用都具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

本研究應(yīng)用近年來(lái)提出的植物DNA 條形碼候選序列ITS2、 PsbA-trnH、rbcL、matK對(duì)波棱瓜屬植物進(jìn)行研究，考察不同DNA 條形碼候選序列在波棱瓜屬藥用植物鑒定中的能力，以期建立波棱瓜屬藥用植物數(shù)字鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

筆者所在課題組共收集110份波棱瓜屬樣本，具體樣本見表1。試驗(yàn)樣本經(jīng)西南民族大學(xué)藥學(xué)院顧健教授鑒定為波棱瓜屬[Herpetospermum pedunculosum （Ser.） C. B. Clarke]葉片和種子。其中葉片樣本100份，都為硅膠干燥的葉片，10份為成熟種子，采樣時(shí)間為2016年9月。測(cè)序公司為生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序 取干燥藥材 30 mg，加入液氮充分碾磨，使用植物DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取總DNA。matK、rbcL、PsbA-trnH、ITS2的擴(kuò)增引物見表2;候選DNA條形碼序列的PCR擴(kuò)增體系見表3。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)主要應(yīng)用的軟件有DANMAN、MEGA version 5.1和SPSS 16.0。運(yùn)用DANMAN軟件查看測(cè)序成功的序列，并將序列錄入到MEGA version 5.1軟件中，進(jìn)行序列之間遺傳距離的分析進(jìn)而構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析保存序列的變異位點(diǎn)、序列的遺傳距離;運(yùn)用SPSS 16.0進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析，比較各個(gè)序列的變異程度;通過(guò)Barcoding gap，查看序列的種內(nèi)、種間差異情況，觀察是否出現(xiàn)顯著gap，進(jìn)一步挑選合適的DNA條形碼片段;運(yùn)用MEGA version 5.1軟件中的鄰接法（NJ），分析不同序列物種識(shí)別和鑒定能力。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹計(jì)算K2P距離，設(shè)100次重復(fù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

陰性對(duì)照（CK）采用加入和模板等量ddH2O后擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，從圖1可以看出，CK組無(wú)條帶，說(shuō)明樣品PCR擴(kuò)增成功，不存在真菌污染，4條序列樣本電泳條帶均明亮，滿足試驗(yàn)要求。

2.2 PCR擴(kuò)增率和測(cè)序成功率

對(duì)樣本的ITS2、matK、PsbA-trnH、rbcL等4條候選序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增效率（出現(xiàn)明顯條帶）和測(cè)序成功率（測(cè)序獲

得高質(zhì)量序列）統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（圖2）顯示，ITS2、matK序列為100.0%，PsbA-trnH序列擴(kuò)增效率為91.0%，rbcL序列擴(kuò)增效率為85.0%;ITS2測(cè)序成功率為100.0%，matK測(cè)序成功率為88.9%，PsbA-trnH、rbcL測(cè)序成功率都為97.8%。

2.3 候選DNA條形碼序列特征

本研究對(duì)不同產(chǎn)地不同海拔波棱瓜樣品的4個(gè)DNA片段ITS2、matK、PsbA-trnH、rbcL進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序所得的序列用DANMAN軟件進(jìn)行排列剪切，然后用MEGA 5.1軟件統(tǒng)計(jì)序列的變異位點(diǎn)、保守位點(diǎn)、序列長(zhǎng)度、GC含量等基本信息。從表4可以看出，在4個(gè)基因片段中，ITS2有54個(gè)變異位點(diǎn)，并且變異程度最高，為22.7%;rbcL變異程度最小，為0.4%;變異程度表現(xiàn)為ITS2>PsbA-trnH>matK>rbcL。因此選擇基于ITS2基因?qū)Σɡ夤喜煌a(chǎn)地及海拔樣品進(jìn)行比對(duì)。序列matK的擴(kuò)增片段最長(zhǎng)，而ITS2最短。

2.4 種內(nèi)種間的變異分析

從表5可以看出，4種序列種間變異平均值由大到小的順序?yàn)镮TS2>PsbA-trnH>rbcL>matK;種間最小變異的順序?yàn)镮TS2>PsbA-trnH>matK>rbcL;種內(nèi)變異平均值順序?yàn)镮TS2>PsbA-trnH>rbcL>matK。通過(guò)對(duì)波棱瓜屬各條形碼候選序列的種間變異、種內(nèi)變異、種間最小變異分析發(fā)現(xiàn)，ITS2序列滿足種間變異應(yīng)當(dāng)大于種內(nèi)變異，并且種間最小變異應(yīng)當(dāng)小于種內(nèi)變異這一條件。

2.5 候選DNA條形碼Wilcoxon秩和檢驗(yàn)

候選DNA條形碼兩兩序列相關(guān)程度，一般通過(guò)Wilcoxon秩和來(lái)檢驗(yàn)。此方法可以更加準(zhǔn)確地反映出兩兩序列樣本的差異程度。從表6可以看出，ITS2序列與其他3條序列具有顯著差異。通過(guò)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ITS2序列種間的變異情況較其他序列快。

2.6 DNA條形碼Barcoding gap檢驗(yàn)

理想的條形碼種間遺傳變異應(yīng)明顯大于種內(nèi)遺傳變異，并在二者之間存在顯著差異，形成一個(gè)明顯的間隔區(qū)，即Barcoding gap。從圖3可以看出，rbcL序列的種內(nèi)遺傳變異值和種間遺傳變異值主要集中在0～0.001區(qū)域，matK序列的種內(nèi)遺傳變異值和種間遺傳變異值集中在0.002～0.003區(qū)域，重疊部分多，無(wú)明顯gap;PsbA-trnH的種內(nèi)遺傳變異值小，均集中在0～0.001區(qū)域，種間遺傳變異值在0～0.001、0.002～0.003區(qū)域均有分布，種內(nèi)種間遺傳變異重疊部分少，gap不明顯。ITS2種內(nèi)遺傳變異值在0～0.004區(qū)域均有分布，種間遺傳變異值分布范圍廣。ITS2的種內(nèi)種間遺傳變異所行成的bar coding gap明顯，但重區(qū)域較小，有利于區(qū)分物種。

2.7 ITS2、PsbA-trnH、rbcL、matK序列NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹鑒定結(jié)果

根據(jù)各序列對(duì)所有樣本構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)行樹（圖4、圖5、圖6、圖7）。從NJ進(jìn)化樹可以看出，PsbA-trnH序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中的樣本有明顯的種內(nèi)差異，沒(méi)有明顯的種間變異，不能鑒別出不同海拔樣品。matK序列和rbcL序列構(gòu)建的進(jìn)化樹可將不同產(chǎn)地不同海拔的樣本聚類成一大類，種間距離很小，無(wú)法區(qū)分，鑒別效果不理想。ITS2序列構(gòu)建的進(jìn)化樹可以很好地區(qū)別出云南波棱瓜，同時(shí)四川省和西藏自治區(qū)樣品聚類為一類，與參照序列聚類距離遠(yuǎn)，有明顯的種間距離。

3 討論

波棱瓜為來(lái)源于葫蘆科波棱瓜屬的植物，以種子入藥，是臨床常用藏藥。波棱瓜屬植物主要分布于青藏高原地區(qū)，在我國(guó)主要分布在西藏自治區(qū)、四川省、云南省，在國(guó)外印度、尼泊爾也有分布。波棱瓜普遍生長(zhǎng)在路邊、林緣及山坡低矮灌木叢中，海拔為 2 300～3 500 m[9-10]。波棱瓜藥用歷史悠久，但存在稱謂混亂導(dǎo)致用藥混亂的現(xiàn)象，因此對(duì)波棱瓜屬植物進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別和鑒定，對(duì)該藥材的安全使用和波棱瓜資源的合理開發(fā)及保護(hù)都十分重要。

本研究通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地不同海拔采集的波棱瓜植物樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序可知，ITS2序列長(zhǎng)度約為238 bp，擴(kuò)增成功率和測(cè)序成功率都為100%，有54個(gè)變異位點(diǎn)，變異率為22.7%，DNA條形碼變異率較高，種間種內(nèi)差異明顯，種間最小變異小于平均溯祖度。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)的結(jié)果是ITS2變異檢驗(yàn)值大于其他3個(gè)序列。從Barcoding gap圖中能夠看出，ITS2種間遺傳變異分布范圍廣，與種內(nèi)遺傳變異值的重疊區(qū)域較小，有利于區(qū)分物種。

PsbA-trnH間隔區(qū)在被子植物中具有高度變異性，其兩端具有75 bp的保守區(qū)序列，便于設(shè)計(jì)通用引物[6，11]，在波棱瓜屬中的擴(kuò)增效率為91%，從Barcoding gap圖中可以看出，PsbA-trnH序列的種內(nèi)和種間遺傳變異值的集中區(qū)域雖然沒(méi)有重疊，但gap不明顯，所以PsbA-trnH序列不適合單獨(dú)作為波棱瓜屬植物的DNA條形碼。matK序列是植物葉綠體DNA 中進(jìn)化較快的一條編碼區(qū)序列，也是多位研究者推薦的條形碼序列之一[6，12-15]。本試驗(yàn)中，matK序列在波棱瓜屬植物中擴(kuò)增效率雖然高，但是測(cè)序成功率僅為88.9%，低于其他3條序列，且種內(nèi)種間重疊部分多，無(wú)明顯gap，因此matK不適合作為條形碼對(duì)波棱瓜屬植物進(jìn)行鑒定。rbcL序列的種間和種內(nèi)遺傳變異值分布區(qū)域接近且無(wú)明顯gap，因而判定rbcL也不適合作為波棱瓜屬植物的DNA條形碼序列。從NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹圖中能夠看出，除ITS2序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹以外，其他3條均不適合獨(dú)自作為波棱瓜屬的條形碼來(lái)區(qū)分不同產(chǎn)地的波棱瓜。

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