甄丹妹 郭景紅 韓興

摘要：為研究玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63活性代謝產(chǎn)物RM對(duì)黃瓜幼苗的誘導(dǎo)抗病性，通過(guò)篩選不同濃度RM對(duì)黃瓜白粉病的防效，得出最佳誘導(dǎo)抗性濃度;采用試劑盒對(duì)RM誘導(dǎo)后接種白粉病菌的黃瓜幼苗進(jìn)行防御酶活性以及活性氧含量變化情況的檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，RM對(duì)黃瓜白粉病的最佳誘抗?jié)舛葹?00 mg/L，施用RM后過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）活性提高，過(guò)氧化氫（H2O2）含量升高。

關(guān)鍵詞：玫瑰黃鏈霉菌;誘導(dǎo)抗病性;黃瓜白粉病;過(guò)氧化氫酶;過(guò)氧化物酶;H2O2

中圖分類(lèi)號(hào)： S436.421.1+2? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0148-03

白粉病是黃瓜種植上危害很普遍、發(fā)病較嚴(yán)重的病害，黃瓜白粉病在全國(guó)各露地和保護(hù)地栽培的黃瓜上均普遍發(fā)生，一般黃瓜生長(zhǎng)中后期病情發(fā)展迅速，導(dǎo)致葉片枯黃、植株干枯，條件適宜時(shí)，幾天時(shí)間內(nèi)，白粉病即可迅速傳遍整個(gè)溫室，造成黃瓜大面積減產(chǎn)[1]。目前生產(chǎn)上對(duì)該病害的防控主要是以化學(xué)防治為主，但由于病原菌對(duì)化學(xué)農(nóng)藥抗藥性的產(chǎn)生以及白粉病病情擴(kuò)展迅速等特點(diǎn)，給其防治帶來(lái)了很大困難，亟需更加環(huán)保、穩(wěn)定、持久的防治方法和策略。近年來(lái)，利用誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)植物自身產(chǎn)生抗病性和進(jìn)行作物免疫的方法作為防治病害更為安全有效、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、環(huán)境友好的新措施，越來(lái)越受到研究者們的關(guān)注和重視[2]。

病原菌侵入植物引起寄主體內(nèi)一系列生理指標(biāo)的變化，可能誘導(dǎo)植株產(chǎn)生一些對(duì)自己生長(zhǎng)有利并且可以在一定程度上抑制病原菌的物質(zhì)，即誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過(guò)氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）等防御酶與植物的抗病反應(yīng)密切相關(guān)，可以作為衡量誘導(dǎo)抗病性的重要指標(biāo)。余曉燕等研究了粉紅單端孢菌體蛋白激發(fā)子誘導(dǎo)杏果產(chǎn)生對(duì)黑斑病的抗性，POD、過(guò)氧化氫酶（CAT）、PPO、β-1-3 葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶活性都有所增強(qiáng)，并檢測(cè)到氧爆發(fā)[3];趙建等發(fā)現(xiàn)施用寡雄腐霉發(fā)酵液對(duì)番茄葉片細(xì)胞膜具有保護(hù)性，能降低丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）、PPO和PAL活性[4];姚佳采用放線菌發(fā)酵液防治油菜菌核病時(shí)，發(fā)現(xiàn)其可以誘導(dǎo)油菜SOD、PPO、POD活性升高[5];薛磊采用生防鏈霉菌ZY153、B49、X4、Z13、S42誘導(dǎo)棉花抗黃萎病時(shí)，發(fā)現(xiàn)其可顯著提高棉花葉片、根系的POD、PPO和PAL活性，增加棉花葉片內(nèi)單寧、二元酚、木質(zhì)素及游離脯氨酸含量[6];暴增海等采用海洋放線菌BM-2發(fā)酵液誘導(dǎo)黃瓜根部防御酶PAL、POD、PPO、SOD活性升高，提高黃瓜對(duì)枯萎病的抗性[7]。另外，活性氧過(guò)氧化氫（H2O2）是一種可以擴(kuò)散的小分子，不僅可以直接殺死病原菌，參與膜脂過(guò)氧化，介入植物過(guò)敏反應(yīng)（HR），而且過(guò)氧化氫還可以導(dǎo)致細(xì)胞壁木質(zhì)化和HR細(xì)胞的死亡，過(guò)氧化氫還可以跨過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入侵染點(diǎn)以外的組織中，作為第2信使激活防衛(wèi)基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致植物對(duì)病原菌產(chǎn)生抗性[8]。一些真菌產(chǎn)生的特異性誘導(dǎo)物能誘導(dǎo)寄主細(xì)胞氧化爆發(fā)，大豆在2種不同的非特異性誘導(dǎo)物Verticillium dahliae 277和Oligogalacturonide作用下，5 min內(nèi)即出現(xiàn)氧爆發(fā)（ROS）[9]。冷害、臭氧、重金屬、傷害、植物激素和病原物侵染等許多逆境都會(huì)產(chǎn)生活性氧，活性氧可以誘導(dǎo)植物激活一些脅迫相關(guān)的基因，對(duì)抗環(huán)境的變化[10]。此外，在細(xì)胞外基質(zhì)中H2O2及其他活性氧的作用不止局限于參與防衛(wèi)反應(yīng)，還參與調(diào)控細(xì)胞壁組分的合成，比如木質(zhì)素合成[11]。

玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63是分離自馬鈴薯瘡痂病自然衰退土壤的1株生防鏈霉菌[12]，筆者從該生防菌發(fā)酵液中分離到1組具有抑菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)分離、提取和結(jié)構(gòu)鑒定，最終確定該活性組分為2種五烯大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌活性代謝產(chǎn)物Roflamycoin和Menmyco-A（簡(jiǎn)稱(chēng)RM），并對(duì)其結(jié)構(gòu)和制備過(guò)程申請(qǐng)了國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利（專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01710091330.X）。為明確玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63活性代謝產(chǎn)物RM誘導(dǎo)植株抗病性的情況及其作用機(jī)制，本研究檢測(cè)分析了RM誘導(dǎo)黃瓜幼苗對(duì)白粉病的抗性與防御酶POD、CAT活性及過(guò)氧化氫含量的關(guān)系，篩選出RM誘導(dǎo)抗病性的最佳濃度，為進(jìn)一步揭示玫瑰黃鏈霉菌代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)抗病性的生理生化作用機(jī)制提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為開(kāi)發(fā)新型植物免疫誘抗劑用于瓜類(lèi)蔬菜白粉病的防控提供了思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 供試黃瓜品種為津春3號(hào)，由天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃瓜研究所提供。

1.1.2 供試菌 供試黃瓜白粉病菌從田間自然發(fā)病的黃瓜植株上采集，用小刷子將采來(lái)的發(fā)病葉片上的白粉孢子刷入無(wú)菌水中，用紗布及漏斗將雜質(zhì)過(guò)濾掉制成孢懸液，并向其中加入少量吐溫-20。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，白粉孢子濃度為 2.2×105個(gè)/mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玫瑰黃鏈霉菌發(fā)酵液的制備 將斜面保存的玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)7 d至孢子成熟，將孢子刮下，制成孢子懸浮液，調(diào)整孢子濃度為5×108 CFU/mL，向裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中接入200 μL孢子懸浮液，30 ℃、200 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)5 d。

1.2.2 玫瑰黃鏈霉菌活性代謝產(chǎn)物RM的提取 發(fā)酵液經(jīng)4 500 r/min離心30 min，棄上清，菌絲沉淀用約3倍體積甲醇浸泡，在超聲波清洗器中振蕩處理30 min，濾紙過(guò)濾得黃色甲醇溶液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50 ℃將甲醇減壓蒸發(fā)至干，加入適量乙酸乙酯，超聲振蕩，使其充分混合，可見(jiàn)有黃色粉末狀物質(zhì)逐漸析出，靜置2 h，抽濾得到黃色粉末狀物質(zhì)，即為代謝產(chǎn)物RM。

1.2.3 RM誘導(dǎo)抗性最佳濃度的篩選 試驗(yàn)于2017年4月10日至5月30日在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院溫室進(jìn)行，將黃瓜種子置于28 ℃培養(yǎng)箱中催芽，待露白時(shí)播種于直徑為15 cm的營(yíng)養(yǎng)缽中（基質(zhì)為V營(yíng)養(yǎng)土 ∶ V土壤=1 ∶ 1），溫室培養(yǎng)至第1張真葉展開(kāi)、第2張真葉展開(kāi)2/3時(shí)待用。對(duì)溫室黃瓜苗先噴施RM藥劑以及對(duì)照藥劑，24 h后噴施白粉病菌的孢懸浮液。共9組處理，每組處理8棵苗，定期觀察并記錄其發(fā)病情況。

1.2.4 溫室誘導(dǎo)抗病性試驗(yàn) 設(shè)置5個(gè)處理：處理1，無(wú)菌水作空白對(duì)照（陰性對(duì)照）;處理2，水楊酸處理，濃度為 5 mmol/L（陽(yáng)性對(duì)照）;處理3，篩選出的最適濃度的RM處理;處理4，只接白粉病菌;處理5，RM處理后接白粉病菌。每個(gè)處理20盆。

用100 mg/L的RM溶液噴霧處理黃瓜幼苗，設(shè)置陰性對(duì)照為水，陽(yáng)性對(duì)照為水楊酸（5 mmol/L），24 h后接種白粉病菌[13]，分別于處理后1、3、5、7 d取樣，采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒進(jìn)行CAT、POD活性測(cè)定和活性氧H2O2含量的測(cè)定。

1.2.5 誘抗結(jié)果的調(diào)查及統(tǒng)計(jì) 白粉病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無(wú)病斑;1級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積5%及以下;3級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積6%～10%;5級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積11%～20%;7級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積21%～40%;9級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積40%以上。

病情指數(shù)=100×∑（各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值）;防治效果=對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)對(duì)照區(qū)病情指數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 RM誘導(dǎo)黃瓜抗病性最佳濃度的篩選

調(diào)查結(jié)果如表2所示，噴施80、100、160 mg/L RM后對(duì)白粉病的防效明顯高于60 mg/L武夷菌素對(duì)照處理;噴施 100 mg/L RM防效最好，因此在后續(xù)的溫室誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)中，選擇100 mg/L RM進(jìn)行噴施處理。

2.2 CAT活性的測(cè)定

CAT是一種誘導(dǎo)酶，由植物本身所引起的CAT活性的增加與其抗病性呈正相關(guān)。由圖1可知，噴施RM處理后3 d CAT活性高于陰性對(duì)照（水）處理，低于陽(yáng)性對(duì)照（水楊酸）處理，5 d時(shí)RM處理與陰性對(duì)照CAT活性接近;噴施RM后接種白粉病原菌處理的CAT活性在處理后5 d與其他處理差異顯著，且達(dá)到最大值，表明噴施RM后再?lài)娛┌追鄄≡幚淼腃AT活性高于只噴施白粉病原菌的處理，噴施RM后CAT活性在病原菌侵染的條件下增加得更為明顯。

2.3 POD活性的測(cè)定

POD在植物抗逆體系中主要用來(lái)消除氧自由基。由圖2可以看出，噴施RM處理后1～3 d與噴施水處理的POD活性接近，5 d達(dá)到最高值，為587.65 U/g，噴施水楊酸后POD活性持續(xù)升高，在5 d達(dá)到最高，噴施水后POD活性增加不明顯，通過(guò)RM處理與陽(yáng)性對(duì)照（水楊酸）、陰性對(duì)照（水）比較可知，噴施RM后可以引起POD活性升高，并與陰性對(duì)照差異顯著;先噴施RM再接種白粉病原菌后5 d，POD活性達(dá)到最高值，為679.26 U/g，只接種白粉病原菌的POD活性也有所升高，但是，先噴施RM后再接白粉病原菌處理的POD活性在處理5 d時(shí)高于只接種白粉病原菌處理。

2.4 H2O2含量的測(cè)定

過(guò)氧化氫屬于活性氧的一種，活性氧主要有超氧陰離子、羥自由基和過(guò)氧化氫。氧爆發(fā)在植株過(guò)敏性壞死反應(yīng)中起著非常重要的作用，病原菌侵染后的很短時(shí)間內(nèi)，活性氧在侵入點(diǎn)急劇增加。由圖3可以看出，噴施RM后接種白粉病原菌，在1～3 d，過(guò)氧化氫含量增加，對(duì)入侵的白粉病菌起到了抵御的作用，在3～7 d，可能由于體內(nèi)防御酶活性增高，將過(guò)氧化氫分解為水，導(dǎo)致H2O2含量降低，只接種白粉病原菌處理和噴施RM處理的H2O2含量在處理后3、5 d稍高于陰性對(duì)照;噴施無(wú)菌水和水楊酸處理的H2O2含量變化不明顯。此外噴施RM處理后再接種病原菌的H2O2含量在3 d達(dá)到最高值，而只噴施白粉病菌的處理則在處理后5 d達(dá)到最高值。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)對(duì)黃瓜白粉病的溫室誘抗試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物RM對(duì)防治黃瓜白粉病具有保護(hù)作用，其誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生白粉病抗性的最佳濃度為100 mg/L。黃瓜葉片噴施RM后引起黃瓜植株內(nèi)過(guò)氧化氫含量增高，抵制了白粉病原菌的侵染，酶活性不同程度的增加，并明顯高于對(duì)照，通過(guò)體內(nèi)防御酶如POD、CAT清除活性氧自由基，防止活性氧含量過(guò)高對(duì)植株的損傷。由于活性氧對(duì)細(xì)胞的毒害作用，植物細(xì)胞具有高效的活性氧清除機(jī)制。活性氧可以被很多酶清除，如參與抗氧化系統(tǒng)的POD、SOD和CAT，它們對(duì)于維持抗氧化系統(tǒng)的平衡具有重要作用。Keppler等使煙草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞感染野火病細(xì)菌后，活性氧大量產(chǎn)生，細(xì)菌數(shù)量明顯下降，但加入SOD等活性氧清除劑后，細(xì)菌數(shù)量增加，并延緩了HR的發(fā)生[14]。CAT、POD等防御酶是存在于植物體內(nèi)與抵制病原微生物侵染有關(guān)的重要酶，RM誘導(dǎo)后引起H2O2含量升高，CAT、POD活性增強(qiáng)，因此誘導(dǎo)抗病性很可能是玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63防病抗病的主要作用機(jī)制之一。除了筆者前期研究中發(fā)現(xiàn)的Men-myco-93-63活性代謝產(chǎn)物具有直接抑菌作用外（數(shù)據(jù)未發(fā)表），該活性產(chǎn)物RM還可以誘導(dǎo)黃瓜植株中主要防御酶活性的提高，并且這種誘導(dǎo)作用在病原菌侵染的條件下表現(xiàn)得更為明顯。研究POD、CAT活性及H2O2含量與玫瑰黃鏈霉菌活性產(chǎn)物誘導(dǎo)黃瓜抗病性的關(guān)系，初步證實(shí)了RM具有誘導(dǎo)抗病性作用，在此基礎(chǔ)上，今后還將對(duì)RM誘抗的信號(hào)途徑、分子機(jī)制進(jìn)行更為深入的研究。

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