都明理 徐嬌 朱楚然

摘要：鏡檢北柴胡、狹葉柴胡、三島柴胡染色體數(shù)目，利用流式細胞技術測定基因組大小，為柴胡基因組測序奠定基礎。采用常規(guī)壓片及顯微鏡方法觀測柴胡體細胞染色體數(shù)目，以柴胡嫩葉為材料，采用LB01解離液和碘化丙啶熒光染料，利用基因組大小已知的番茄（H-1706、潘那利）作為內(nèi)標，采用流式細胞術對其基因組大小進行測定。結果表明，北柴胡、三島柴胡體細胞染色體數(shù)目分別為12、26條，基因組大小估測分別為989.80 Mb和2.14 Gb;狹葉柴胡群體內(nèi)存在2種類型：一種類型的葉片窄，成熟植株的根外皮為棕紅色，染色體數(shù)為12條;另一種葉片較寬，成熟植株的根外皮為淺黃色，染色體數(shù)為26條，基因組大小估測分別為782.50 Mb和1.92 Gb。3種柴胡的染色體數(shù)目確定和基因組大小估測可為柴胡全基因組測序和細胞學等研究提供依據(jù)。

關鍵詞：柴胡;流式細胞技術;基因組大小;染色體數(shù)目

中圖分類號： S567.23+9.01? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0191-03

柴胡是多年生草本植物，以干燥根入藥，是我國常用的大宗中藥材之一，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣等功效。《中華人民共和國藥典》2015版一部規(guī)定，柴胡正品藥材為傘形科植物北柴胡（Bupleurum chinense DC.）和狹葉柴胡（B. scorzonerifolium Willd.）的干燥根[1]。三島柴胡（B. falcatum L.）為日本藥用柴胡栽培品種，在我國也有種植[2]。

隨著測序技術的發(fā)展，越來越多藥用植物的全基因組完成了測序[3-5]。藥用植物全基因組信息的明確將快速推動其分子水平相關研究的深入開展，有助于人們了解和利用其遺傳及代謝機制。全基因組測序前通常需確定染色體數(shù)目，預估基因組大小。目前進行基因組大小評估的主要方法包括孚耳根微顯影法[6]、流式細胞術[7]以及Survey測序法[8]。流式細胞術具有操作簡單和分辨率、準確率高的優(yōu)點，被廣泛地應用于測定不同物種（如黃芩[9]、巴戟天[10]、靈芝[11]等）基因組大小的研究中。

柴胡屬植物體態(tài)呈禾草狀，形態(tài)變異大，花、果結構相對來說變異較小，但其種類劃分仍是植物分類鑒定方面的難點之一。同時，柴胡屬是一個染色體多基數(shù)的屬，基數(shù)以6、7、8常見[12]。姜傳明等對黑龍江省及東北柴胡屬的研究發(fā)現(xiàn)，三島柴胡為二倍體，2n=20或2n=26;北柴胡染色體數(shù)目為 2n=12 或2n=24，推測其可能為四倍體;狹葉柴胡為二倍體，染色體數(shù)目為2n=12[13-14]。郭麗華的研究表明，北柴胡、三島柴胡、狹葉柴胡染色體數(shù)目分別為2n=24、2n=26、2n=12[15]。劉宏偉在對北柴胡品種川北柴1號的染色體鏡檢中發(fā)現(xiàn)，其染色體數(shù)目為2n=12[16]。邵天玉在對北柴胡和狹葉柴胡的染色體進行比較研究時發(fā)現(xiàn)，北柴胡和狹葉柴胡的染色體數(shù)目分別為2n=18和2n=8[17]。可見同一種柴胡的染色體數(shù)目也存在很大變化。柴胡屬不同種基因組大小預測可見報道的有6個種，包括三島柴胡，為2.72 Gb，不包括北柴胡和狹葉柴胡[18-19]。本研究鏡檢擬進行基因組測序的柴胡樣品染色體數(shù)目，并預測基因組大小，旨在為柴胡全基因組測序奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

北柴胡選擇中柴2號品種，狹葉柴胡選擇黑龍江省明水縣種植品種，三島柴胡選擇河北安國種植品種。從各產(chǎn)區(qū)種植點收集種子，統(tǒng)一種植于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所栽培育種試驗基地?；蚪M大小估測試驗中作為內(nèi)標（對照）的番茄為Solanum lycopersicon（H-1706番茄，基因組大小為950 Mb）和S. pennellii（潘那利番茄，基因組大小為 1.25 Gb）。

1.2 試驗方法

1.2.1 染色體數(shù)目測定 柴胡種子萌發(fā)后，待根長至 0.5 cm 時取根尖，置于飽和對二氯苯和α-溴代萘水溶液中，在4 ℃冰箱中預處理12 h后，用甲醇與冰醋酸（V甲醇 ∶ V冰醋酸=3 ∶ 1）固定1 h以上，1 mol/L鹽酸45 ℃處理45 min，蒸餾水沖洗，然后用卡寶品紅染色，常規(guī)壓片，顯微鏡觀察并選取分散良好的分裂相照相。

1.2.2 流式細胞技術測定柴胡基因組大小

1.2.2.1 細胞核懸液的制備與DNA特異性染色 采集柴胡樣品的新鮮葉片組織，每個樣品取20～50 mg，分別置于加入1 mL LB01解離液（配方見表1）的培養(yǎng)皿中，并迅速用鋒利的刀片將其快速切碎。溫和地吸取培養(yǎng)皿中的解離液過濾至1.5 mL 的EP管中，加入100 μL碘化丙啶熒光染料，置于 4 ℃ 冰箱中避光染色10 min，隨即上機檢測。對照樣品的處理方法同上，并將待測樣品與對照樣品進行混合制樣（細胞核懸液進行等比例混勻），每個上機樣品中有3 000～5 000個細胞核。

1.2.2.2 基因組大小測定及計算 上機前將樣品振蕩5 s，采用488 nm的藍光激發(fā)，收集625/26通道的熒光，檢測PI發(fā)射的熒光強度以確定DNA相對含量;再通過流式細胞儀自帶的軟件Summit 5.2分析數(shù)據(jù)并進行顯著性統(tǒng)計分析?；蚪M大小計算方法：待測樣本基因組大小=對照樣本基因組大小×[（待測樣本G0/G1峰熒光強度）/（對照樣本G0/G1峰熒光強度）]，其中G0/G1表示處于G0和G1細胞分裂期的細胞數(shù)量比值。

2 結果與分析

2.1 染色體數(shù)目測定

采用傳統(tǒng)的根尖染色體制片法進行鏡檢，結果（圖1）發(fā)現(xiàn)，北柴胡品種中柴2號和三島柴胡的體細胞染色體數(shù)目分別為12、26條;狹葉柴胡存在2種類型，一種類型葉片窄，成熟植株的根外皮為棕紅色，體細胞染色體數(shù)為12條，另一種類型葉片寬，成熟植株的根外皮為淺黃色，體細胞染色體數(shù)為26條。

2.2 基因組大小的測定

以2種番茄（H-1706番茄和潘那利番茄）為內(nèi)標，分別測定4個柴胡樣品的基因組大小，測定樣品和內(nèi)標混合后的PI發(fā)射熒光強度，結果（圖2）發(fā)現(xiàn)，峰P1和P2分別為番茄內(nèi)標和柴胡樣品的熒光峰，可見兩者分度較好，無重疊現(xiàn)象。根據(jù)“1.2.2.2”節(jié)中的公式計算得到，北柴胡、三島柴胡基因組大小分別為989.80 Mb、2.14 Gb;狹葉柴胡群體中2種類型植株，窄葉紅根類型的基因組大小為782.50 Mb，寬葉淺黃根類型的基因組大小為1.92 Gb（表2）。

3 結論與討論

染色體有種屬特異性，不同地區(qū)居群所產(chǎn)生的形態(tài)變異與它們的染色體數(shù)和核型變異相聯(lián)系，因此染色體變異可較為直接地反映物種在環(huán)境條件作用下的遺傳變異性，染色體資料是從本質(zhì)上探討分類和進化的有效資料之一。柴胡屬不同種染色體數(shù)目變化較大，存在多種基數(shù)，同一種內(nèi)也存在不同基數(shù)和不同倍性現(xiàn)象。基數(shù)x為4，是傘形科中發(fā)現(xiàn)的最低染色體基數(shù)。北柴胡已報道的基數(shù)有x=6和x=10，已報道的北柴胡多倍體類型有四倍體2n=4x=24和八倍體2n=8x=48[12]，本研究測定的北柴胡樣品染色體數(shù)目為2n=12，應為基數(shù)x=6的二倍體。三島柴胡染色體數(shù)目同樣存在不同情況的報道，本研究測得26條染色體，是報道中較常見的類型，結合以往報道，三島柴胡樣品應為基數(shù)x=13的二倍體。狹葉柴胡樣品中存在2種類型，其中窄葉類型根外皮為棕紅色，應為真正的狹葉柴胡，染色體數(shù)目為2n=12，也是較常見的類型;寬葉類型根外皮為淺黃色，可能是種植過程中混合了其他柴胡種質(zhì)。

借助流式細胞儀來測定植物基因組大小具有簡單、快速、準確的特點，所以應用得越來越廣泛。但在實際的測定過程中，提取液、提取材料、內(nèi)標植物的選擇均可能對其基因組大小估測的準確性有一定影響。筆者后期又利用二代高通量測序技術（Illumina Hiseq 2000）測定了北柴胡、狹葉柴胡（窄葉紅根類型）和三島柴胡的基因組大小，測序數(shù)據(jù)采用 Kmer=17進行分析，預估3種柴胡基因組大小分別為 1.03 Gb、746.52 Mb和2.08 Gb（待發(fā)表），該結果與流式細胞術測得的結果基本相符，表明流式測定結果可靠，而以往報道預測的三島柴胡基因組大小為2.72 Gb[18]，可能是由于材料的差異或是試驗過程的差異。

致謝：感謝中國科學院植物研究所公共技術服務中心提供的流式細胞技術，感謝中國科學院植物研究所公共技術服務中心的楊素華工程師在流式細胞術測定柴胡基因組大小試驗中提供的幫助。

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