晏云濤 俸江琴 趙汝

摘要：為調(diào)查云南大理某地區(qū)豬源致病性大腸桿菌對(duì)鏈霉素、卡那霉素、新霉素、妥布霉素、阿米卡星和慶大霉素的耐藥性，并獲悉氨基糖苷類2個(gè)耐藥基因strA、strB的攜帶情況，試驗(yàn)采用抗菌藥物敏感試驗(yàn)紙片法探究55株大腸桿菌對(duì)6種氨基糖苷類藥物的耐藥性，通過常規(guī)PCR檢測(cè)strA、strB攜帶率。結(jié)果表明，鏈霉素、卡那霉素、新霉素、妥布霉素、阿米卡星和慶大霉素的耐藥率依次為50.9%、40.0%、30.9%、43.6%、12.7%、41.8%。strA、strB檢出率分別為76.4%和72.7%，同時(shí)含有2種耐藥基因的頻率高達(dá)50.9%，說明云南大理受檢地區(qū)豬源致病性大腸桿菌的耐藥情況嚴(yán)重。

關(guān)鍵詞：豬源致病性大腸桿菌;耐藥性;耐藥基因;氨基糖苷;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

中圖分類號(hào)：S858.282.61+2?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0222-03

大腸桿菌（Escherichia coli）是腸桿菌科細(xì)菌的模式種，是在特定條件下可引起人畜共患病的一種病原菌，是在養(yǎng)豬業(yè)中最常見的病原菌之一。大腸桿菌可引起敗血癥、水腫病、新生仔豬腹水和仔豬黃白痢等多種疾病，并且具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。

為避免大腸桿菌病的產(chǎn)生，農(nóng)戶與豬場(chǎng)通常會(huì)把氨基糖苷類藥物加入飼料中飼喂畜禽[2]，以便對(duì)各種大腸桿菌疾病進(jìn)行預(yù)防和控制，但隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用和在疾病治療中的不當(dāng)使用，常導(dǎo)致豬場(chǎng)環(huán)境中大腸桿菌耐藥菌株產(chǎn)生，對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥性發(fā)生變化[3-4]。大腸桿菌耐藥菌株對(duì)氨基糖苷類的耐藥機(jī)制主要有3種：一是細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)異常使藥物在細(xì)菌體內(nèi)的蓄積減少或者細(xì)菌外膜蛋白通透性發(fā)生改變;二是出現(xiàn)氨基糖苷類鈍化酶;三是藥物作用靶位改變[5-6]，使藥物進(jìn)入細(xì)菌后不可以有效地與核糖體結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性。楊慧等發(fā)現(xiàn)，飼料中添加銅鹽導(dǎo)致豬銅抗性基因的產(chǎn)生，同時(shí)協(xié)同選擇了氨基糖苷類藥物strA、strB耐藥基因的產(chǎn)生[7]。這些認(rèn)識(shí)有利于對(duì)云南大理豬源致病性大腸桿菌耐藥性、耐藥基因進(jìn)行研究。

本試驗(yàn)采用筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離保存的云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌進(jìn)行6種氨基糖苷類抗生素耐藥性檢測(cè)，strA和strB屬于編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，用來編碼修飾鏈霉素鈍化基因，對(duì)耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲悉其耐藥性與耐藥基因關(guān)系，以明確云南大理被檢測(cè)區(qū)豬源致病性大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥情況，旨在為今后的獸醫(yī)臨床用藥提供參考，為豬源致病性大腸桿菌在畜禽體內(nèi)的抗逆機(jī)制和耐藥機(jī)制研究提供幫助。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)菌株

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室保存的55株，于2017年6月從云南省大理市部分豬場(chǎng)腹泄仔豬糞便中分離純化好的豬源致病性大腸桿菌。

1.2 主要試劑

藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒，購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其他試劑，均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

1.3 藥敏試驗(yàn)

選用抗菌藥物敏感試驗(yàn)紙片法對(duì)6種氨基糖苷類藥物（鏈霉素、妥布霉素、新霉素、慶大霉素、卡那霉素和阿米卡星）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)參見美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI）所推薦的抗菌藥物敏感試驗(yàn)紙片法[8]。

1.4 細(xì)菌基因組DNA的提取

按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書中方法進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的提取，最后溶于40 μL TE緩沖液中備用。

1.5 PCR擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)[9]，在GenBank上，找到序列并下載序列，用Prmier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列及信息見表1。

PCR反應(yīng)體系見表2。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3.0 min;94 ℃ 0.5 min，55 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1.0 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。在1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果在紫外燈下觀察并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照記錄保存。

2 結(jié)果和分析

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表3、圖1）顯示，分離純化后的55株云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌對(duì)鏈霉素的耐藥率最高，達(dá)50.9%，其次是妥布霉素（43.6%）、慶大霉素（41.8%）、卡那霉素（40.0%）、新霉素 （30.9%），耐藥率最低的是阿米卡星（12.7%）。

2.2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 目的基因strA擴(kuò)增結(jié)果 由圖2可知，在55株云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌中出現(xiàn)42株陽性菌株，strA陽性率為76.4%，所得條帶片段大小為197 bp。

2.2.2 目的基因strB擴(kuò)增結(jié)果 由圖3可知，在55株云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌中出現(xiàn)40株陽性菌株，strB陽性率為72.7%，所得條帶片段大小為326 bp。

3 討論

展天松等對(duì)江蘇地區(qū)大腸桿菌耐藥性分析結(jié)果顯示，對(duì)阿米卡星耐藥率最低，僅為15.7%，對(duì)鏈霉素耐藥率最高為 62.9%[10]，與本研究結(jié)果大致相同，原因可能是鏈霉素價(jià)格較為低廉，抗菌譜廣，眾多農(nóng)戶長(zhǎng)期大量使用此類藥物預(yù)防和治療疾病。朱永江等對(duì)40株畜禽大腸桿菌常用氨基糖苷類抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，對(duì)卡那霉素耐藥率高達(dá)57.5%[11]，與本試驗(yàn)結(jié)果存在較大出入，產(chǎn)生此種現(xiàn)象原因可能是不同地區(qū)養(yǎng)殖模式和預(yù)防觀念不同，也可能與研究基數(shù)有關(guān)，或與地區(qū)用藥差異有關(guān)，相關(guān)影響因素還需進(jìn)一步調(diào)查。

金文杰等在對(duì)216株大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)到編碼修飾鏈霉素的鈍化酶基因strA的陽性率為56%，strB的陽性率為65.7%[12]。本試驗(yàn)中， 在55株云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌中strA陽性率為 76.4%，strB陽性率為72.7%，其中有28株菌株同時(shí)存在strA和strB耐藥基因，占 50.9%，表明豬源致病性大腸桿菌普遍攜帶耐藥基因strA和strB，進(jìn)一步說明大腸桿菌的耐藥性和耐藥基因存在關(guān)系。

云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物的耐藥特性有所改變，在用藥時(shí)需選有效藥。其中，合理用藥是關(guān)鍵，合理選擇用藥，具體為開發(fā)新藥、使用以耐萬古霉素腸球菌（VRE）[13]和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）[14]為靶點(diǎn)的新抗生素和發(fā)展生物制劑;目前，已知黃連、金銀花、艾葉、五倍子4類中藥水提物對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出明顯的抑菌效果[15]，尋找安全有效治療豬大腸桿菌病的藥物是畜牧養(yǎng)殖業(yè)中亟待解決的關(guān)鍵問題。耐藥性的差異可為畜場(chǎng)合理選用獸藥提供依據(jù)，掌握不同時(shí)期大腸桿菌的耐藥情況，便于防控大腸桿菌疾病，以選擇合理的方案進(jìn)行用藥。抗菌藥物的大量使用，使細(xì)菌更容易自發(fā)突變，加快耐藥性傳播和擴(kuò)散。不同豬場(chǎng)大腸桿菌可能存在不同的耐藥譜和耐藥率，獸醫(yī)臨床應(yīng)根據(jù)本場(chǎng)病原菌的藥敏特征正確選用合適的防治藥物。

4 結(jié)論

55株云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌對(duì)6種氨基糖苷類抗生素存在不同程度的耐藥率，使這6種氨基糖苷類藥物不能完全有效發(fā)揮作用，其中對(duì)鏈霉素耐藥率最高，達(dá)到50.9%，且檢測(cè)到編碼修飾鏈霉素的鈍化酶基因strA陽性率為76.4%，strB陽性率為72.7%，充分說明耐藥基因與耐藥表型具有一定相關(guān)性。大腸桿菌耐藥性的普遍存在對(duì)畜牧業(yè)具有一定的影響，需要進(jìn)一步控制。只有抑制耐藥性的產(chǎn)生、阻斷耐藥機(jī)制的形成，才能真正地防治云南大理部分地區(qū)豬源致病性大腸桿菌疾病。

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