張宏博 王 巖 郭 莉 范 鑫 阿拉坦朝格蘭 鄭玉山

內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 內(nèi)蒙古呼和浩特 010090

近年來，隨著農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛使用，越來越多的科研人員將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了食品中農(nóng)藥的殘留上來[1]。郎爽、魏巖等人多次分析了噴灑了農(nóng)藥的農(nóng)業(yè)土地中含有殘留物質(zhì)所采用的研究方法，實(shí)驗(yàn)中所檢測(cè)的多種土質(zhì)中存在的相關(guān)農(nóng)藥的回收后都有很好的體現(xiàn)，該方法已經(jīng)在現(xiàn)實(shí)生活中使用[2]。蔣俊樹等人建立氣質(zhì)聯(lián)用法在同一時(shí)間檢測(cè)了茶類產(chǎn)品中所存留下的藥品，證實(shí)了其具有較高的靈敏度[3]。

惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯和γ-666為農(nóng)業(yè)上較長(zhǎng)見的殺菌藥品，可用于防治黃瓜、葡萄、櫻桃、蔬菜等植物，如霜霉病、枯萎病等，它也可用于治療不同類型的繼發(fā)疾病，如褐斑病和黑腐病等[4]。隨著農(nóng)藥在飼料中的大量使用，其在肉制品中的殘留也不可忽視[5]。隨著人們生活水平的提高，肉制品的品質(zhì)越來越受到人們的重視[6,7]。然而，大部分研究都集中于肉的理化品質(zhì)[8]和食用品質(zhì)[9,10]，對(duì)肉制品的安全品質(zhì)大多集中于肉的摻雜摻假[11]和獸藥殘留[12]，而對(duì)肉制品中的農(nóng)藥殘留的相關(guān)研究卻少之又少。

當(dāng)前，檢測(cè)食物中農(nóng)藥殘留技術(shù)陸續(xù)的被研究、擴(kuò)展和完善，一些高超的技術(shù)、新工藝也頻繁地被發(fā)明出來，例如，納米生物檢測(cè)技術(shù)、微流控技術(shù)、分子印跡檢測(cè)技術(shù)，但最廣泛使用的農(nóng)業(yè)藥品剩余物檢測(cè)技術(shù)是色譜檢測(cè)技術(shù)和生化檢測(cè)技術(shù)[13]。因此，本文在色譜檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)部分檢測(cè)條件，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對(duì)肉制品中惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯和γ-666四種較常見農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)，并與相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，最終優(yōu)化相關(guān)的檢測(cè)方法，為肉制品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法的開發(fā)提供一定的理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

樣品于2017年11月和2018年8月分別從內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特左旗和蘇尼特右旗采集，共采集6個(gè)蘇木/嘎查/村24只活羊。屠宰場(chǎng)屠宰后取背最長(zhǎng)肌5 000g冷凍帶回儲(chǔ)存。

1.1.2 試劑

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：惡霜靈，濃度(ug/mL)99.5；三氯殺螨醇，濃度(ug/mL)99.0；生物芐呋菊酯，濃度(ug/mL)99.0；γ媚-666，濃度(ug/mL)98.6。農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品來源均為Dr.Ehrenstorfer GmbH，定容體積(mL)均為100。

輔助試劑：Acetonitrile，規(guī)格色譜純，來源Fisher公司；Sinchers提取鹽包，規(guī)格色譜純，來源Quechers Extract Pouch EN Method。

1.1.3 設(shè)備和耗材

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：絞肉機(jī)，型號(hào)GM200，廠家Retsch GobH；電子天平，型號(hào)ME204E，廠家梅特勒-托利多；高速離心機(jī)，型號(hào)Avanti J-26S XP，廠家BECKMAN COuLTER；氣相色譜儀，型號(hào)ISQ-LT，廠家Thermo ISQ-Trace 1300。

試驗(yàn)耗材：Sinchers固相萃取柱，規(guī)格900mg Na2SO4、150mg PSA、150mg C18、Cat.No:112-9669-153，品牌AnyBond安邦健合；色譜柱，規(guī)格0.25m×0.25mm×30m，品牌Agilent DB1701。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱量惡霜靈農(nóng)標(biāo)準(zhǔn)品0.01024g，三氯殺螨醇農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品0.01004g，生物芐呋菊酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品0.01027g，γ-666農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品0.01024g，用Acetonitrile作為定容試劑。

惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯、γ-666四種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度如表1所示。

將這些儲(chǔ)備液按照一定的濃度混合成新的儲(chǔ)備液，將儲(chǔ)備液的瓶口用錫紙和封口膜封住放在溫度為4℃的冰箱中保存。

表1 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

準(zhǔn)確的稱取Heptachlor epoxide試劑，然后用Acetonitrile溶解，放在100mL容量瓶中。內(nèi)標(biāo)溶液的配制如表2所示。

表2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

1.2.3 樣品前處理

精密稱取經(jīng)預(yù)處理的羊肉樣品1g于50mL離心管中，精密吸取400uL Heptachlor epoxide內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(35ug/mL)加入樣品中，加入10mL去離子水，搖晃使樣品充分溶解。然后加入10mL Acetonitrile，用旋渦機(jī)高速下旋渦2min，超聲波清洗機(jī)超聲20min。向離心管中加入sinchers酸性鹽包，劇烈振蕩，冷卻后5 000rpm高速離心5min，離心管中加入sinchers固相柱，按壓至Acetonitrile層全部進(jìn)入收集管中，過0.45um有機(jī)濾膜后進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.4 儀器條件

1.2.4.1 GC條件

色譜柱類型：超低流失毛細(xì)管色譜柱。

色譜柱型號(hào)：DB-1701。

柱膜厚：25cm。

柱內(nèi)徑：0.025cm。

柱長(zhǎng)：3 000cm。

載氣類型：He。

載氣流速：1.2mL/min。

進(jìn)樣口的溫度為280℃，載氣為He，每次進(jìn)入1uL，不分流進(jìn)樣。

儀器程序升溫如表3所示。

表3 儀器程序升溫

1.2.4.2 MS條件

傳輸線溫度280℃，離子源溫度250℃，數(shù)據(jù)采集方式SIM。

定性方法：本實(shí)驗(yàn)利用保留時(shí)間結(jié)合利用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院圖譜庫兩種方法協(xié)助定性。

表4 分析農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品所需的相關(guān)數(shù)據(jù)

定量方法：利用SIM對(duì)試樣進(jìn)行觀察，然后通過樣品校正后峰面積的大小與之前配制的標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液的比值經(jīng)過儀器做出相關(guān)的數(shù)學(xué)關(guān)系圖，如果檢測(cè)的試樣中存在所要分析的目標(biāo)物質(zhì)而且其濃度也在國(guó)家所規(guī)定的濃度區(qū)間內(nèi)，就可以通過此種方法對(duì)目標(biāo)物質(zhì)按照其含量和濃度準(zhǔn)確的分析計(jì)算。

分析農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品所需的相關(guān)數(shù)據(jù)如表4所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率及線性范圍

本方案在更新了多種檢測(cè)條件后的惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯和γ-666四種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及回收率

結(jié)果顯示，惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯和γ媚-666四種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)系數(shù)均在回收率80%～120%區(qū)間內(nèi)，表明該檢測(cè)方法適合檢測(cè)這四種農(nóng)藥。

2.2 檢出限和精密度

本設(shè)計(jì)方案在更新了多種實(shí)驗(yàn)條件的性質(zhì)下分析了惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯和γ媚-666四種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限和精密度(RSD)。其中，RSD是指用一模一樣檢測(cè)方法多次對(duì)同一種試樣中的所需物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過重復(fù)檢測(cè)后復(fù)現(xiàn)性的頻率，RSD越小精密度越高。

因?yàn)樗獧z出物質(zhì)的存在量是非常小的，所以本方案以可檢出的限量為GC-MS法的評(píng)價(jià)規(guī)定，可檢出物質(zhì)的量是所要檢測(cè)的物質(zhì)，由電信號(hào)轉(zhuǎn)換成譜圖后的峰面積的高度與通過噪聲檢測(cè)出的電信號(hào)轉(zhuǎn)換的峰的高度之比如果>3，則說明所要檢測(cè)的物質(zhì)有一定量的測(cè)出，如表6所示。

表6 樣品檢測(cè)結(jié)果

圖1 Oxadixyl標(biāo)準(zhǔn)譜圖 RT：29.81min

圖2 Dicofol標(biāo)準(zhǔn)譜圖 RT：21.49min

圖3 Bioresmethrin標(biāo)準(zhǔn)譜圖 RT：27.66min

圖4 γ-666標(biāo)準(zhǔn)譜圖 RT：17.88min

結(jié)果顯示，蘇尼特羊肉中惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯和γ媚-666的檢出限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)檢出限，符合標(biāo)準(zhǔn)要求，即算作沒有農(nóng)藥殘留被檢測(cè)出來。四種農(nóng)藥的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在個(gè)規(guī)定區(qū)間內(nèi)，該檢測(cè)的準(zhǔn)確度好，顯示該研究方法對(duì)此實(shí)驗(yàn)適用。

2.3 氣相色譜的條件分析

優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件有色譜柱的進(jìn)樣量、樣品進(jìn)入儀器的方式、樣品進(jìn)樣式所需的溫度以及溫度不斷升高時(shí)的速率。

2.3.1 色譜進(jìn)樣方式

試驗(yàn)肉樣中實(shí)際上是含有極少藥品存留下來的，如果把樣品通過多個(gè)通道進(jìn)入到儀器中，一多半待檢測(cè)的物質(zhì)在進(jìn)入儀器時(shí)會(huì)被儀器感受不到，靈敏度可能會(huì)下降很多，所以采取讓樣品從同一個(gè)通道進(jìn)入儀器中，進(jìn)入的時(shí)間為1.5min。

2.3.2 柱流量的優(yōu)化

樣品產(chǎn)生的譜圖的峰形狀會(huì)受到樣品在進(jìn)入到色譜柱后不同速度的流速影響，如果進(jìn)入時(shí)的速度很小就會(huì)導(dǎo)致譜圖上峰變成又低又寬的樣子，如果速度太大又會(huì)造成柱中原來固定存在的物質(zhì)被沖流走，這些都是造成儀器對(duì)樣品分離時(shí)的影響因素，本實(shí)驗(yàn)采用的柱中樣品的流速為1.2mL/min。

2.3.3 進(jìn)樣口溫度

樣品通過進(jìn)樣口進(jìn)入時(shí)的溫度既要使樣品中所要檢測(cè)的物質(zhì)在這個(gè)溫度可以沸騰氣化又要使送樣品進(jìn)入的柱子不能在這個(gè)溫度下發(fā)生變化。以惡霜靈為例，以250℃為最開始的溫度，逐步升高10℃，分析其相對(duì)應(yīng)數(shù)值的變化，依據(jù)數(shù)值在其中挑選出最好的進(jìn)樣溫度，本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)樣溫度為280℃。

表7 進(jìn)樣口溫度與響應(yīng)值

2.3.4 進(jìn)樣體積

襯管可以控制樣品進(jìn)入儀器量的多少，進(jìn)入量太大時(shí)，樣品發(fā)生汽化后的體積就會(huì)超過襯管固定的容納量，因此會(huì)使所要檢測(cè)的主要物質(zhì)發(fā)生流失，而且樣品如果進(jìn)入儀器太多會(huì)給色譜柱增加太大的負(fù)擔(dān)，給實(shí)驗(yàn)帶來不良后果。進(jìn)入的體積比正常的少時(shí)，則所要檢測(cè)的物質(zhì)的絕對(duì)進(jìn)入量要比原來小很多，實(shí)驗(yàn)的檢出范圍就會(huì)受到一定的影響。本實(shí)驗(yàn)的樣品進(jìn)入儀器的體積為1uL。

2.3.5 升溫速度

儀器中所設(shè)置的溫度上升裝置是非常有利于所要檢測(cè)的物質(zhì)進(jìn)行全部分離，不一樣的速度下升高溫度對(duì)檢測(cè)的試樣也有大不相同的分離能力。依據(jù)所要檢測(cè)試樣的性質(zhì)不同，對(duì)溫度進(jìn)行設(shè)置時(shí)要參考其分離度和信噪比。本設(shè)計(jì)的最后加熱程序是，柱的溫度首先是40℃，保持時(shí)間是60s，30℃/min的溫度被加熱到130℃，然后在5℃/min加熱至250℃，最后從10℃/min升溫至270℃，持續(xù)時(shí)間300s。

2.3.6 色譜柱

食品中藥品殘留的檢測(cè)經(jīng)常采用的毛細(xì)管色譜柱有兩種型號(hào)(DB-5MS和DB-1701)，為了使實(shí)驗(yàn)不受色譜柱因素控制，選用新的DB-1701型號(hào)為本方案的檢測(cè)柱。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

對(duì)所研究的這幾種藥品的標(biāo)準(zhǔn)液體進(jìn)行掃描，獲得這幾種藥品的圖譜。然后采用選擇性離子監(jiān)測(cè)模型篩選這四種藥品的特征離子，然后對(duì)試樣檢測(cè)研究。

2.4.1 定性分析

實(shí)驗(yàn)的定性分析遵循兩條原則：一是試樣在圖譜上出現(xiàn)峰的時(shí)間與藥品標(biāo)準(zhǔn)品峰出現(xiàn)的時(shí)間共同在所規(guī)定的檢測(cè)區(qū)間內(nèi)；二是所檢測(cè)的離子都可以被檢出而且對(duì)離子定性和定量分析后的豐度比不超出所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間。

2.4.2 定量方式

定量方式包括外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法，外標(biāo)法有非常廣泛的使用范圍，但由于樣品在自動(dòng)進(jìn)入檢測(cè)儀器的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)一系列不穩(wěn)定反應(yīng)，因此造成實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果出現(xiàn)偏差，所以采用內(nèi)標(biāo)法定量。

內(nèi)標(biāo)法最重要的就是內(nèi)部標(biāo)記物，在對(duì)內(nèi)部標(biāo)記物進(jìn)行選擇時(shí)，要考慮實(shí)驗(yàn)設(shè)備是否對(duì)內(nèi)部標(biāo)記物靈敏，內(nèi)部標(biāo)記物是否對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有較好的反應(yīng)，內(nèi)部標(biāo)記物的色譜峰需和樣品的色譜峰分開，而且內(nèi)部標(biāo)記物的出峰時(shí)間要和待檢測(cè)的物品的出峰時(shí)間相接近，內(nèi)部標(biāo)記物要與目標(biāo)物的化學(xué)性質(zhì)類似，內(nèi)部標(biāo)記物與色譜柱里的固定相發(fā)生有關(guān)反應(yīng)。本次使用環(huán)氧七氯作為內(nèi)部標(biāo)記物。

3 結(jié)論

通過使用超低流失毛細(xì)管色譜柱，調(diào)節(jié)進(jìn)樣口的溫度為280℃，載氣He每次進(jìn)入1uL且不分流進(jìn)樣。MS傳輸線溫度為280℃、離子源溫度為250℃、數(shù)據(jù)采集方式為SIM可以實(shí)現(xiàn)對(duì)羊肉進(jìn)行農(nóng)藥惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯和γ-666的精確測(cè)定。