馮學超 陳露露 杜可玉 李勇鵬 趙凌俠*

(1.上海交通大學農業(yè)與生物學院植物生物技術研究中心，上海 200240； 2.上海交通大學農業(yè)與生物學院番茄聯(lián)合研究中心，上海 200240)

雄蕊是開花(flowering plant)/被子(Angiosperms)植物花雄性生殖器官，與植物繁殖、物種延續(xù)、果實發(fā)育及產(chǎn)量形成密切相關；其雄性配子體發(fā)育經(jīng)歷了造孢細胞、花粉母細胞、小孢子發(fā)育成成熟花粉生物學過程[1]。盡管模式植物擬南芥(Arabidopsisthalina)、水稻(Oryzasativa)、煙草(Nicotianatabacum)和番茄(Solanumlycopersicum)小孢子發(fā)育已進行廣泛的研究[2～8]，而物種間遺傳背景和進化方式的差異必將表現(xiàn)出小孢子發(fā)育的多樣性。茄科毛酸漿(Physalispubescens)與模式植物親緣關系較遠，其小孢子發(fā)育與番茄差異將為深入研究茄科植物花發(fā)育提供重要參考；特別是花萼膨大成“燈籠形”包被果實這一獨特的生物學特性可以免遭環(huán)境污染或損傷。毛酸漿作為半野生水果風味獨特，富含多糖、氨基酸、礦物質、維生素類、類胡蘿卜素、生物堿和酸漿苦素；還具有抗氧化、降壓、利尿、抗菌、鎮(zhèn)痛、消炎、強心、催產(chǎn)、降血脂和抗癌等臨床功效[9～14]?！侗静菥V目》記載：“酸漿利濕除熱。利濕故能化痰治疽，除熱故清肺治咳”。

基于此，本研究采用比較生物學方法解析毛酸漿(P.pubescens)與番茄(S.lycopersicumvar.cerasiforme)花形態(tài)特征和小孢子發(fā)育，以期為深入研究毛酸漿及揭示茄科植物花發(fā)育提供一些信息。

1 材料方法

1.1 植物材料

毛酸漿(Physalispubescens)系黑龍江省(121°11′～135°05′E，43°26′～53°33′N)地方品種，種子是購自哈爾濱市鮮果剖取陰干后所得；櫻桃番茄(S.lycopersicumvar.cerasiformeNo.22)種子保存于上海交通大學番茄聯(lián)合研究中心。溫湯(45℃)浸種60 min，室溫浸種8 h，26℃育苗箱催芽。待種子露白(胚芽初現(xiàn))播種于裝有濕潤育苗土60孔育苗穴盤(1粒/穴)；4片真葉展開時小苗定植于上海交通大學浦江綠谷基地日光溫室，正常水肥管理。

1.2 取樣和組織切片制備

從-11～0 dpa(開花當日days post anthesis)每天上午8～10時取毛酸漿花蕾/花朵，以櫻桃番茄為參照。用電子游標卡尺(CD-15CPX,Mitutoyo,Japan)測量花器大小，用相機(Canon，EOS 800D，Japan)拍照。為了觀察小孢子發(fā)育，將不同發(fā)育期花蕾在FAA液(37%甲醛∶冰醋酸∶無水乙醇∶雙蒸水=v∶v∶v∶v=5∶5∶63∶27)中固定，抽真空更換新FAA液4℃保存。梯度乙醇脫水(70%、80%、95%)30 min，無水乙醇脫水2 h；曙紅(上海源葉生物有限公司，上海)乙醇飽和溶液著色。樣品預滲透(無水乙醇：Basne Luqizd Technoovt 7100=v∶v=1∶1)2 h；25℃條件滲透(1 g硬化劑Ⅰ溶于100 mL Basne Luqizd Technoovt 7100中,Kulzer and Co.,Wehrheim,Germany)過夜。在灌注包埋液(硬化劑Ⅱ∶滲透液=v∶v=1∶14)包埋板上包埋樣品；48℃加熱10 min，60℃烘箱中硬化48 h。用半薄切片機(Leica RM2265，Germany)切成厚3 μm切片。蒸餾水展片，酒精燈烘干殘余水粘片于載玻片。用1%甲苯胺藍水溶液(甲苯胺藍∶硼酸∶雙蒸水=w∶w∶v=1∶1∶100，Toluidine Blue O，TBO)染色40 s，雙蒸水洗去殘余染液；烘干后滴加中性樹膠加蓋玻片通風櫥中過夜風干；中性樹膠封片，在顯微鏡(Nikon Eclipse 80i,USA)下觀察小孢子發(fā)育并拍照。

2 結果分析

2.1 花形態(tài)特征

毛酸漿(P.pubescens)為單花腋生，比櫻桃番茄花小，番茄系復總狀花序，假二叉分枝(圖1:a，e)。毛酸漿花萼基部相連，中裂成“鐘”狀(圖1:c，i)；櫻桃番茄花萼深裂至基部，均為綠色花萼(圖1:d，k)。毛酸漿5枚淡黃色花瓣交疊呈“五角星”花冠，花瓣有紫色“眼狀”斑紋，并與花藥齊平(圖1:b，i)。櫻桃番茄“披針”花瓣深裂基部相連，黃色(圖1:e～f，k)。毛酸漿淡紫花藥借助花絲著生于花瓣基部，頂頸可育，背部開裂散粉(圖1:b，i)。櫻桃番茄黃色花藥頂頸不育，通過花絲著生花基部、側連成花藥錐，腹縫開裂散粉(圖1:g，k)。毛酸漿和櫻桃番茄花柱淺綠色(圖1:c，h)，前者短于后者(表1)。

圖1 毛酸漿(P.pubescens)與櫻桃番茄(S.lycopersicum var.cerasiforme No.22.)花器形態(tài)與發(fā)育 A.毛酸漿花；B.毛酸漿花瓣和雄蕊；C.毛酸漿雌蕊和花萼；D.櫻桃番茄花萼；E.櫻桃番茄花；F.櫻桃番茄花瓣；G.櫻桃番茄雄蕊；H.櫻桃番茄雌蕊；I.毛酸漿花發(fā)育(-11～0 dpa)；J.毛酸漿果實(7 dpa)；K.櫻桃番茄花發(fā)育(-11～0 dpa)；L.櫻桃番茄果實(7 dpa)Fig.1 Morphologicalcharacteristics and development of the flower in P.pubescens and S.lycopersicum var.cerasiforme No.22 A.Flowerof P.pubescens; B.Petals and stamens of P.pubescens; C.Sepals and pistils of P.pubescens; D.Sepal of S.lycopersicum var.cerasiforme; E.Flower of S.lycopersicum var.cerasiforme; F.Petal of S.lycopersicum var.cerasiforme; G.Stamen of S.lycopersicum var.cerasiforme; H.Pistil of S.lycopersicum var.cerasiforme; I.Development of buds of P.pubescens(-11-0 dpa); J.Fruitof P.pubescens(7 dpa); K.Development of buds of S.lycopersicum var.cerasiforme(-11-0 dpa); L.Fruitof S.lycopersicum var.cerasiforme(7 dpa)

種Species花萼長Sepal length花萼寬Sepal width花藥長Anther length花絲長Filament length花柱長Style length毛酸漿P.pubescens5.20±0.502.10±0.102.13±0.183.05±0.514.09±0.15櫻桃番茄S.lycopersicum var.cerasiforme8.60±1.301.40±0.105.94±0.220.94±0.195.50±0.22

表2 小孢子發(fā)育關鍵特征期

毛酸漿花瓣紫色斑紋、紫花藥背裂散粉與茄屬(Solanum)番茄族(Lycopersicumsection)乳白花藥、頂頸可育和頂端散粉的類番茄茄(S.lycopersicoides)，黃花藥、頂頸可育、腹縫開裂散粉的潘那利番茄(S.pennellii)及花藥黃色、頂頸不育、腹縫開裂散粉的秘魯番茄(S.peruvianum)和栽培番茄(S.lycopersicum)的花器特征明顯不同。

2.2 小孢子發(fā)育

第一階段，U形造孢期(-11 dpa)。毛酸漿花蕾長1 mm，萼片緊閉(圖1:i)。花藥表皮層、藥室內壁、中層和橫切絨氈層清晰可見；橫切“蝶形”花藥由藥隔和連結組織分成4個藥室，原表皮下的基本分生組織分化形成單層“U”形孢原細胞(archesporial cell)(圖2:a)。而櫻桃番茄花蕾1.25 mm；花粉囊的藥室和造孢細胞初顯(圖3:a)。

第二階段，造孢細胞平周分裂期(-10 dpa)。花蕾(淡黃色)長1.5 mm，緊閉(圖1:i)。單層造孢細胞經(jīng)過平周分裂成雙層(圖2:b)。櫻桃番茄花蕾長1.5 mm、緊閉(圖1:k)；藥室內壁細胞平周分裂成多層；花粉囊腔室造孢細胞平周分裂至2～3層，細胞體積變大形成清晰內凹“C”形造孢細胞群(圖3:b)。

第三階段，小孢子母細胞形成期(-9 dpa)。毛酸漿花蕾長2.31 mm、緊閉(圖1:i)。造孢細胞經(jīng)平周和垂周分裂、體積增大，形成有棱角小孢子母細胞；藥室內壁細胞平周分裂成雙層(圖2:c)。同期的櫻桃番茄綠色花蕾長3.88 mm、微張(圖1:k)；造孢細胞進入“四分體”時期，經(jīng)多次平周分裂藥室內壁細胞分化成多層；中層細胞和絨氈層也清晰可見(圖3:c)。

第四階段，四分體時期(-8 dpa)?；ɡ匍L度與-9 dpa(2.31 mm)相近，而徑向生長明顯，花蕾(黃色)仍處于閉合狀態(tài)。小孢子母細胞進入“四分體”時期，并開始與絨氈層產(chǎn)生離層(圖2:d)。而櫻桃番茄綠色花蕾開口逐漸變大，長4.25 mm(圖1:k)；“四分體”發(fā)育成單獨的小孢子，絨氈層變薄或并開始解體，藥室腔增大(圖3:d)。

第五階段，單核小孢子早期(-7～-6 dpa)。黃色花蕾長至2.46 mm，仍處于閉合狀態(tài)(圖1:i)。“四分體”發(fā)育成不規(guī)則/帶棱角小孢子，不過小孢子外壁因造孢素沉積和內容物較少仍僅被甲苯胺藍染成淺藍；中層細胞為小孢子發(fā)育提供營養(yǎng)而被吸收并逐漸消失，藥室藥隔組織僅存2～3層內壁細胞(圖2:e～f)。櫻桃番茄綠色花蕾長5.38 mm、微開花瓣初顯(圖1:k)；而花粉囊藥隔組織發(fā)育迅速，沿藥室藥隔組織內凸明顯不同于毛酸漿(圖3:e～f)。

第六階段，單核小孢子中期(-5 dpa)。閉合的淡黃花蕾長4.15 mm(圖1:i)。小孢子體積逐漸變大，形狀不規(guī)則；絨氈層解體僅存少許殘片(圖2:g)。而此時的櫻桃番茄，花蕾長6.38 mm，花瓣從萼片伸出約0.5 mm(圖1:k)。小孢子變圓，絨氈層嚴重解體僅存殘片；藥隔組織向藥室內凸更加明顯(圖3:g)。

第七階段，小孢子發(fā)育晚期(-4 dpa)。萼片變綠，“鐘形”花蕾長4.77 mm，微張，隱約可見淡黃花瓣(圖1:i)。小孢子體積逐漸變大，顏加深(圖2:h)。櫻桃番茄“柱形”綠色花蕾長7.13 mm，頂端微張，白色花瓣從萼片伸出1.63 mm(圖1:k)；小孢子變圓并被甲苯胺藍染成深色；藥隔組織繼續(xù)向藥室內突(圖3:h)。

第八階段，花粉形成初期(-3 dpa)。花蕾縱向生長緩慢，徑向生長迅速，萼片打開，黃色花瓣清晰可見(圖1:i)。球形小孢子因孢粉素沉積和內容物增加而被染成深藍色；中空的隔膜組織接近崩潰(圖2:i)。而櫻桃番茄花蕾長8 mm，花瓣從萼片伸出2 mm(圖1:k)；小孢子發(fā)育成近圓形多面體，隔膜組織也開始降解；藥隔組織繼續(xù)向藥室內凸(圖3:i)。

第九階段，花粉成熟早期(-2 dpa)?；ɡ匍L6.62 mm，花萼停止生長，黃色花瓣從花萼伸出2.0 mm(圖1:i)。球形花粉成熟，隔膜組織消失，藥室變二為一(圖2:j)。櫻桃番茄花蕾長6.9 mm，花瓣伸出5.3 mm，此時花蕾仍保持閉合(圖1:k)。球形花粉大小不一，接近成熟，隔膜降解也使藥室變二為一；藥隔組織仍快速向藥室內凸(圖3:j)。

第十階段，花粉成熟期(-1 dpa)。大花蕾長7.23 mm，花瓣伸出花萼3.1 mm并疊抱，花蕾仍處于閉合狀態(tài)(圖1:i)?；ǚ鄢墒?，花藥裂口區(qū)域僅存1層細胞(圖2:k)。櫻桃番茄花蕾長8.0 mm，黃色花瓣微張伸出花萼6.1 mm(圖1:k)。花粉成熟，裂口區(qū)僅存1層細胞，藥隔組織繼續(xù)向藥室內凸(圖3:k)。

第十一階段，散粉期(0 dpa)。淡黃瓣展開(圖1:a～d)。藥囊背縫開裂，花粉散出(圖2:l)。櫻桃番茄黃色花瓣展開，祼露出黃色花藥，進入開花期(圖1:k)?；ㄋ幐箍p開裂，成熟花粉散出，藥隔組織繼續(xù)發(fā)育并伸至藥室中部，約占藥室空間的1/2(圖3:l)。

圖2 毛酸漿小孢子發(fā)育(-11～0 dpa) a～l.毛酸漿小孢子在-11～0 dpa期的發(fā)育 C.藥隔組織；E.表皮層；En.藥室內壁；ML.中層；MMC.小孢子母細胞；MSp.小孢子細胞；PG.花粉粒；Sm.隔膜組織；Sp.造孢細胞；StR.裂口區(qū)域；T.絨氈層；Tds.四分體；V.維管束組織；Va.液泡Fig.2 The microspore development in P.pubescens during -11-0 dpa a-l. Indicatemicrospore developmentstages during -11-0 dpa C. Connective tissue; E. Epidermis; En. Endothecium; ML. Middle layer; MMC. Microspore mother cells; MSp. Microspores; PG. Pollen grains; Sm. Septum; Sp. Sporogenous cells; St. Stomium; StR. Stomium region; T. Tapetum; Tds. Tetrads; V. Vascular bundle; Va. Vacuoles

圖3 櫻桃番茄小孢子發(fā)育(-11～0 dpa) a～l.小孢子不同發(fā)育期(-11～0 dpa) C.藥隔組織；E.表皮層；En.藥室內壁；ML.中層；MMC.小孢子母細胞；MSp.小孢子細胞；PG.花粉粒；Sm.隔膜組織；Sp.造孢細胞；StR.裂口區(qū)域；T.絨氈層；Tds.四分體；V.維管束組織；Va.液泡Fig.3 The microspore development in S.lycopersicum var.cerasiforme No.22 during -11-0 dpa a-l. Indicatemicrospore development stages during -11-0 dpa C. Connective tissue; E. Epidermis; En. Endothecium; ML. Middle layer; MMC. Microspore mother cells; MSp. Microspores; PG. Pollen grains; Sm. Septum; Sp. Sporogenous cells; St. Stomium; StR. Stomium region; T. Tapetum; Tds. Tetrads; V. Vascular bundle; Va. Vacuoles

3 討論

毛酸漿(P.pubescens)和櫻桃番茄(S.lycopersicumvar.cerasiforme)均為茄科黃色漿果類植物，二者花器形態(tài)存在明顯差異。開花(0 dpa)前，毛酸漿花萼生長緩慢，開花后未開裂基部生長迅速并形成“燈籠罩”包被果實(圖1:i～j)。櫻桃番茄5枚花萼基部不聚合，在開花前、后生長速度沒有明顯改變，無花萼包被果實的現(xiàn)象(圖1:k～l)。毛酸漿淡黃花瓣紫色斑紋、淡紫花藥在花瓣基部著生、頂頸可育、不側連和背部開裂散粉方式與櫻桃番茄明顯不同，后者黃色花瓣和花藥、花藥“頂頸不育”、側連成花藥錐、腹縫開裂散粉(圖1:k～l)。盡管二者均起源于南美大陸，這些花器形態(tài)差異可能與其適應南美的復雜生態(tài)環(huán)境、傳粉昆蟲對花色偏愛的協(xié)同進化有關[15]。

毛酸漿(P.pubescens)和櫻桃番茄(S.lycopersicumvar.cerasiforme)小孢子發(fā)育進程也不盡相同。至“四分體”時期，毛酸漿發(fā)育比櫻桃番茄遲(圖2:a～d，圖3:a～d)；而從“四分體”后至花粉成熟卻表現(xiàn)出毛酸漿小孢子發(fā)育快于櫻桃番茄趨勢(圖2:e～l，圖3:e～l，表2)。同時，組織學分析發(fā)現(xiàn)，櫻桃番茄在小孢子發(fā)育初期藥隔組織開始向藥室內凸，至花粉成熟期約占據(jù)藥室空間的1/2，而毛酸漿中卻無該生物學特征(圖2:e～l，圖3:e～l)，這可能與物種間進化差異有關，而該結構的生物學功能還有待研究。

茄科(Solanaceae)是80余個屬近3000個種的植物大家族，物種間遺傳多樣性極其豐富。用比較生物學方法研究毛酸漿(P.pubescens)和櫻桃番茄花器植物學特征和小孢子發(fā)育，對理解茄科植物物種形成、花發(fā)育、繁衍和產(chǎn)量形成具有重要的科學意義。