盧雪佳 劉方炎 高成杰 李 昆

(中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，昆明 650224)

車桑子(Dodonaeaviscosa(Linn.) Jacq.)隸屬于無患子科(Sapindaceae)車桑子屬(Dodonaea)，灌木或小喬木。它具有耐干旱、萌生能力強、根系發(fā)達(dá)和叢生性等生長習(xí)性，是一種良好的保水固土植物，常被用作造林困難地區(qū)的先鋒樹種，具有較高的生態(tài)價值[1]。在我國金沙江干熱河谷地區(qū)，車桑子亦是稀樹灌叢、灌叢及灌草叢等鄉(xiāng)土植被類型的重要組成成分[2]。

野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，車桑子開花量大，但結(jié)籽率低，種子敗育率較高，自然更新能力較差。研究表明植物自身的生殖過程、種子的萌發(fā)、幼苗的生長等自身因素以及外界環(huán)境因素及人為干擾因素等均能限制植物自然更新[3]。目前，對車桑子的研究主要集中在其干旱脅迫下種子及幼苗的生長狀況[4]、光合特性及光合水分生理特性[5]、各項生態(tài)因子對種子的萌發(fā)特性及影響幼苗生長發(fā)育的影響[6～7]、葉片旱生結(jié)構(gòu)特征[8]、藥用價值[9]等方面研究。尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)車桑子繁殖特征及繁殖生物學(xué)方面的研究報道。本文采用常規(guī)石蠟切片法對車桑子的大孢子發(fā)生及雌配子體的發(fā)育過程進(jìn)行觀察和研究，試圖從生殖生物學(xué)方面探究影響車桑子結(jié)籽率和種子敗育的原因。同時，文中分析了車桑子花朵的外部形態(tài)特征與其內(nèi)部發(fā)育狀況的聯(lián)系，為通過外部形態(tài)判斷大孢子發(fā)育時期提供一定依據(jù)。本試驗擬為車桑子的生殖生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

于2017和2018年車桑子開花時期，在云南省楚雄自治州元謀縣干熱河谷區(qū)稀樹灌草叢植被中，選取不同發(fā)育階段的車桑子雌花花蕾和花朵，保存于FAA固定液(50%酒精90 mL∶甲醛5 mL∶冰醋酸5 mL)中，帶回實驗室后，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

大孢子發(fā)生與雌配子體發(fā)育過程的觀察采用常規(guī)石蠟切片法。即從固定液中取不同發(fā)育時期的花蕾及花朵，剝離花萼后經(jīng)系列脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋。用切片機進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為8～10 μm，番紅—固綠進(jìn)行對染，中性樹脂封片，蔡司光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。車桑子不同時期花蕾結(jié)構(gòu)的外部特征采用體式顯微鏡觀察并拍照。

2 觀察結(jié)果

2.1 車桑子大孢子的發(fā)生

車桑子子房是三個心皮合生構(gòu)成三心室、中軸胎座的結(jié)構(gòu)，每個心室具有上、下兩個胚珠(圖1：A)。花柱中空形成花柱道(圖1：B)。胚珠具有兩層珠被，且為橫生胚珠，無承珠盤(圖1：C)。

在心皮的內(nèi)側(cè)沿心皮的合縫上，最初產(chǎn)生一團向心室內(nèi)腔突起的細(xì)胞即胚珠原基。隨著進(jìn)一步發(fā)育，胚珠原基的前端部分細(xì)胞發(fā)育成珠心，胚珠原基的基部部分細(xì)胞發(fā)育成珠柄。在珠心端，珠心表皮細(xì)胞下出現(xiàn)一個細(xì)胞質(zhì)濃厚、細(xì)胞核明顯，體積較大的細(xì)胞即孢原細(xì)胞(圖1：D)，此時珠被并未分化。隨后，孢原細(xì)胞經(jīng)過平周分裂和垂周分裂后，形成一個周緣細(xì)胞及一個造孢細(xì)胞(圖1：E)。造孢細(xì)胞經(jīng)過進(jìn)一步的發(fā)育，形成大孢子母細(xì)胞(圖1：F)，早期的內(nèi)外兩層珠被均出現(xiàn)。大孢子母細(xì)胞經(jīng)過第一次減數(shù)分裂形成一個二分體(圖1：G)，經(jīng)過第二次減數(shù)分裂形成四個成直線形排列的大孢子細(xì)胞，即四分體(圖1：H)，此時內(nèi)珠被高度還未超過珠心，而外珠被高度已超過珠心。隨著發(fā)育的進(jìn)行，靠近珠孔端的三個大孢子細(xì)胞開始逐漸退化，靠近合點端的一個大孢子進(jìn)一步發(fā)育，形成功能大孢子(圖1：I)。功能大孢子進(jìn)一步發(fā)育，逐漸占據(jù)部分珠心細(xì)胞形成具有大液泡的單核胚囊(圖1：J)，其余三個大孢子已退化消失。此時內(nèi)外珠被均已形成，且珠心完全包裹在兩層珠被內(nèi)。胚囊的發(fā)育類型屬于單孢子蓼型，珠心組織是由多層細(xì)胞組成的厚珠心類型。

2.2 車桑子雌配子體的發(fā)育

隨著單核胚囊的繼續(xù)發(fā)育，單核胚囊的細(xì)胞核逐漸移向胚囊中心。隨后進(jìn)行一次有絲分裂，形成兩個新核(圖1：K)，并且這兩個新核逐漸向相反方向移動(圖1：L)。接著這兩個新核相繼進(jìn)行第二次有絲分裂，形成四個核，即四核胚囊(圖1：M)。這四個游離核進(jìn)行第三次有絲分裂，形成八個游離核即八核胚囊(圖1：N)。之后，每端各有一個游離核移向胚囊中央部位，這兩個游離核組成極核(圖1：O)，并隨著細(xì)胞化組成一個形狀較大的中央細(xì)胞(圖1：Q)?？拷榭锥说娜齻€游離核逐漸細(xì)胞化，其中一個較大的細(xì)胞被稱為卵細(xì)胞，其余兩個較小的被稱為助細(xì)胞，共同組成卵器(圖1：P)。遠(yuǎn)離珠孔端的三個游離核，繼續(xù)細(xì)胞化形成三個細(xì)胞，即反足細(xì)胞(圖1：O)。

圖1 車桑子大孢子和雌配子體發(fā)育過程 A.子房橫切；B.花柱橫切；C.橫生胚珠；D.孢原細(xì)胞；E.周緣細(xì)胞和造孢細(xì)胞；F.大孢子母細(xì)胞；G.二分體；H.四分體；I.功能大孢子；J.單核胚囊；K.二核胚囊；L.兩個游離核反向移動；M.四核胚囊；N.成熟胚囊；O.反足細(xì)胞和極核；P.卵器；Q.中央細(xì)胞；R～T.異常胚囊 Ac.孢原細(xì)胞；Sc.造孢細(xì)胞；Pc.周緣細(xì)胞；Mmc.大孢子母細(xì)胞；Fm.功能大孢子；Pn.極核；At.反足細(xì)胞；Sy.助細(xì)胞；Ec.卵細(xì)胞Fig.1 Megasporogensis and female gametophyte of D.viscosa A.Cross-section of ovary; B.Cross-section of stylus; C.Amphitropous ovule; D.Archesporial cell; E.Sporogenous cell and parietal cell; F.Megaspore mother cell; G.Diad; H.Tetrad; I.Functional megaspore; J.Uninucleate embryo sac; K.Two-nucleate embryo sac; L.Reverse movement of two free nuclei; M.Four-nucleate embryo sac; N.Mature embryo sac; O.At Antipodal cell and polar nuclei; P.Egg apparatus; Q.Central cell; R-T.Abnormal embryo sac Ac.Archesporial cell; Sc.Sporogenous cell; Pc.Parietal cell; Mmc.Megaspore mother cell; Fm.Functional megaspore; Pn.Polar nuclei; At.Antipodal cell; Sy.Synergid cell; Ec.Egg cell

此外，車桑子雌配子體發(fā)育過程中出現(xiàn)少數(shù)異?，F(xiàn)象。(1)成熟胚囊中細(xì)胞不明顯，并且胚囊中并非中空，胚囊中有一層組織細(xì)胞連接珠孔端和合點端(圖1：R、S)。(2)成熟胚囊中細(xì)胞核并未進(jìn)一步細(xì)胞化，而是仍以八個游離核的狀態(tài)存在(圖1：T)。

2.3 雌花發(fā)育特征與其內(nèi)部結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系

通過對雌花的花芽開始膨大到雌花的萎蔫的一系列形態(tài)發(fā)育過程的觀察(表1，圖2)，結(jié)合雌花內(nèi)部結(jié)構(gòu)的發(fā)育過程，綜合分析可發(fā)現(xiàn)，雌花的外部發(fā)育情況可以大致反映內(nèi)部結(jié)構(gòu)的發(fā)育情況。當(dāng)雌花處于小花蕾(圖2：A)時，車桑子內(nèi)部結(jié)構(gòu)中心皮原基開始出現(xiàn)。隨著雌花的發(fā)育，花蕾開始萌動伸長(圖2：B～C)，此時內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬于孢原細(xì)胞出現(xiàn)并開始分裂形成造孢細(xì)胞的過程。當(dāng)花蕾進(jìn)一步伸長并膨大，柱頭形成并且伸長(圖2：D)，此時內(nèi)部發(fā)育為從造孢細(xì)胞發(fā)育為大孢子母細(xì)胞，并開始進(jìn)行減數(shù)分裂，少數(shù)處于二分體時期。當(dāng)雌花的柱頭微微露出萼片，子房膨大(圖2：E)，此時大孢子母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂，呈現(xiàn)二分體、四分體狀態(tài)。隨著柱頭的進(jìn)一步伸長，伸出萼片一段長度(圖2：F)，雌蕊進(jìn)入單核胚囊階段。萼片尖處變紅且開始展開，處于開花前期(圖2：G)，雌蕊的單核胚囊進(jìn)行兩次有絲分裂，形成二核、四核胚囊。開花初期，部分萼片展開，子房膨大(圖2：H)，此時進(jìn)行第三次有絲分裂，開始出現(xiàn)八核胚囊。盛花期，萼片全部展開，子房外露且膨大明顯(圖2：I)，雌花處于成熟胚囊期。

圖2 車桑子雌花的發(fā)育過程Fig.2 The female flower development of D.viscosa

階段Stage外部形態(tài)特征External morphological characteristics內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)育過程Internal structure development processA小花蕾期The period of small flower buds心皮原基出現(xiàn)Carpel primordia appearB-C花蕾開始萌動、伸長Flower buds begin to sprout and elongate孢原細(xì)胞分裂形成造孢細(xì)胞Archesporial cells split to form sporogenous cellsD花蕾進(jìn)一步膨大、伸長,柱頭形成Flower buds swell and elongate,Stigma formation大孢子母細(xì)胞到二分體時期The period from megaspore mother cell to diadE露白期,柱頭開始稍微露出萼片外White appearing, the stigmas begin to reveal slightly outside the sepals二分體到四分體時期The period from diad to tetradF柱頭逐漸伸長,露出萼片外一定長度The stigmas gradually elongate, revealing a certain length outside the sepals單核胚囊期The period of uninucleate embryo sacG柱頭進(jìn)一步伸長,萼片包裹開始松展The stigmas extend further and the sepals begin to loosen二核胚囊到四核胚囊期The period from two-nucleate embryo sac to four- nucleate embryo sac H開花初期,萼片部分展開In the early period of flowering, the sepals spread out partially出現(xiàn)八核胚囊Eight- nucleate embryo sac appearsI盛開期,萼片全部展開In full blooming, the sepals are all spread out成熟的八核胚囊Mature eight- nucleate embryo sac

3 討論

車桑子子房為3心皮構(gòu)成的3心室，中軸胎座，胚珠橫生，具有兩層珠被，厚珠心，且每個心室有上下兩個胚珠，無承珠盤。大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成直線型排列的四分體，靠近合點端的大孢子分化為功能大孢子，其余三個大孢子逐漸退化消失。胚囊發(fā)育類型為單孢子蓼型。成熟胚囊是8核7細(xì)胞類型。這些胚胎學(xué)特征與同車桑子亞科的文冠果(Xanthocerassorbifolium)、掌葉木(Handeliodendronbodinieri)及茶條木(Delavayatoxocarpa)的特征基本相同，但文冠果每個心室有5～8個胚珠排成兩列，發(fā)育前期為彎生胚珠，后變?yōu)榈股咧?，掌葉木是彎生胚珠，茶條木子房2心室，文冠果(X.sorbifolium)、掌葉木(H.bodinieri)和茶條木(D.toxocarpa)的這些胚胎學(xué)特征區(qū)別與車桑子[10～12]。作為車桑子屬的模式植物，本試驗揭示了車桑子的大孢子發(fā)生與雌配子體的發(fā)育過程，其雙珠被、厚珠心及單孢子蓼型發(fā)育等胚胎學(xué)特征較為原始[13]。這些為車桑子屬植物的胚胎學(xué)發(fā)育特征提供了一定依據(jù)，同時豐富了車桑子亞科植物胚胎學(xué)發(fā)育特征的基礎(chǔ)資料。

植物的生殖成功需要經(jīng)歷一系列復(fù)雜過程，貫穿植物的整個生活史周期，出現(xiàn)任何問題將會影響生殖的成功與否[14～15]。一般來說，植物的開花、坐果、種子萌發(fā)及幼苗生長等是研究種子植物生殖生物學(xué)的基礎(chǔ)[15]。自然狀況下，有性生殖的成功與否直接影響了植物生長的數(shù)量多少和種群的擴大[16]。據(jù)研究表明，干熱河谷地區(qū)車桑子存在種群自然更新困難的問題[3]。種子的敗育可能是導(dǎo)致天然更新不良的原因之一。根據(jù)筆者調(diào)查，金沙江干熱河谷區(qū)車桑子的結(jié)籽率較低，僅為(22.5±2.5)%，其自然結(jié)籽率低的原因有待探明。胚胎學(xué)特征和環(huán)境條件等能引起種子的敗育，植物大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育過程中出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象是引起種子敗育的主要胚胎學(xué)原因之一[17]。主要集中在以下幾個方面：(1)大孢子發(fā)生異常。軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta)雄株胚珠原基不發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致大孢子不育[18]；香木蓮有約27.9%的功能大孢子退化[19]。馬蹄參(Diplopanaxstachyanthus)的功能大孢子發(fā)生敗育，進(jìn)而引起其余三個大孢子隨機一個發(fā)育為功能大孢子[20]。(2)卵細(xì)胞發(fā)生異常。紅花木蓮(Manglietiainsignis)的成熟胚囊中約有79.1%卵細(xì)胞敗育[21]。香木蓮(Manglietiaaromatica)約有80%的 卵器在受精前提前退化[19]。(3)胚囊發(fā)育異常。馬蹄參(D.stachyanthus)二核胚囊期出現(xiàn)二核的大小不均現(xiàn)象，且馬蹄參(D.stachyanthus)成熟的胚囊中約有98.8%的胚囊腔中僅有一個較明顯的細(xì)胞[20]。喜樹(Camptothecaacuminata)出現(xiàn)很多沒有胚囊核的空腔[22]。翅果油樹(Elaeagnusmollis)的成熟胚囊出現(xiàn)部分胚囊小的異常現(xiàn)象[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，車桑子成熟胚囊出現(xiàn)少數(shù)異?，F(xiàn)象，一方面成熟胚囊中并非中空的且細(xì)胞不明顯，胚囊中有一層組織細(xì)胞連接珠孔端和合點端。另一方面成熟胚囊中游離核并未進(jìn)一步細(xì)胞化，而是仍以八個游離核的狀態(tài)存在。車桑子的異?，F(xiàn)象將可能導(dǎo)致生殖細(xì)胞的無法形成，進(jìn)而無法正常受精。據(jù)此推測，車桑子雌花發(fā)育過程中的胚囊異常發(fā)育現(xiàn)象和游離核的不正常發(fā)育可能是導(dǎo)致其自然結(jié)籽率低的原因之一。此外，導(dǎo)致植物自然結(jié)籽率低的原因很多，如性別器官的形成是否正常、小孢子發(fā)生和雄配子發(fā)育是否正常、生殖細(xì)胞的發(fā)育是否正常、傳粉受精的過程是否有障礙以及胚珠發(fā)育成種子的過程是否出現(xiàn)異常等。因此，車桑子自然結(jié)籽率低的問題還可以從生殖過程的各個環(huán)節(jié)探尋其原因，且對于雌配子體發(fā)育異常的現(xiàn)象產(chǎn)生原因還需進(jìn)一步研究。