劉志強(qiáng) 曹純玉 李亞文 渠娟娟 賈云乾 裴雁曦

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,特色植物資源研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030006)

交流是一種重要的生存能力，人與人之間、動(dòng)物與動(dòng)物之間，以及細(xì)胞與細(xì)胞之間都存在著獨(dú)特的交流方式，那么植物與植物之間呢？它們是否也在“竊竊私語”？答案是肯定的。

自由跨膜是氣體信號(hào)分子的特征之一[21]。生理濃度下的外源H2S處理可以提高植物對(duì)多種脅迫的抗性；并且脅迫會(huì)引起植物內(nèi)源H2S含量的升高[22～23]，那么當(dāng)植株受到環(huán)境脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的H2S是否會(huì)釋放到空氣中，成為植株間的報(bào)警信號(hào)，在植株間起到通訊的作用？本論文對(duì)此進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所用植物材料包括：擬南芥(Col-0、lcd/des1突變體)、谷子(晉谷21號(hào))、白菜(津育75號(hào))、番茄(MicroTom)。選擇飽滿的種子，4℃春化48 h，種植在營養(yǎng)土和蛭石(2∶1)的混合基質(zhì)中，生長(zhǎng)4周。培養(yǎng)條件為：溫度23±1℃，60%相對(duì)濕度，晝/夜周期16/8 h，光照強(qiáng)度為3 000 lx。

1.2 植物葉片H2S含量的測(cè)定

參考Li等的方法[24]，0.1 g葉片用2 mL提取液(50 mmol·L-1磷酸緩沖液pH6.8，0.2 mol·L-1抗壞血酸和0.1 mol·L-1EDTA)研磨；將勻漿液轉(zhuǎn)移到可密閉的小瓶中，放置含0.5 mL 1% Zn(Ac)2溶液的吸收小管，向勻漿中加入1 mL HCl(1 mol·L-1)，密封小瓶；于室溫反應(yīng)30 min，向吸收管加入DPD和FeCl3溶液，混勻避光放置15 min，測(cè)溶液667 nm的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出H2S濃度后，再根據(jù)公式計(jì)算H2S含量。

H2S含量(μmol·g-1FW)=H2S濃度×(0.5+0.2+0.2)×0.001/鮮重

(1)

1.3 空氣中H2S濃度的檢測(cè)

對(duì)照組和PEG 8000處理組植物材料分別置于玻璃缸內(nèi)(7 L)，放置含0.5 mL 1% Zn(Ac)2溶液的EP管，用于吸收缸內(nèi)空氣中的H2S氣體，12 h后取出EP管，分別加200 μL DPD(Dimethyl-p-phenylenediamine，20 mmol·L-1)和FeCl3(30 mmol·L-1)溶液，混勻避光放置15 min，測(cè)溶液667 nm的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算空氣中H2S濃度，為0 h數(shù)據(jù)。向處理組植物材料的土壤中加20 mL 40% PEG 8000，放置Zn(Ac)2溶液，12 h后檢測(cè)。之后每12 h放置新的Zn(Ac)2溶液，分別為脅迫24、36、48 h樣品。對(duì)照組不進(jìn)行脅迫處理，置于玻璃缸，每12 h放置新的Zn(Ac)2溶液。

1.4 PEG 8000處理植株對(duì)鄰近植物H2S含量和基因表達(dá)的影響

谷子幼苗分為A、B兩組，分別置于7 L的玻璃缸內(nèi)。A組為對(duì)照(Control)，缸內(nèi)植株不進(jìn)行脅迫處理；B組缸內(nèi)植株分為PEG 8000處理植株和非處理(un-PEG 8000)植株；處理時(shí)向處理植株的土壤加入20 mL 40% PEG 8000，處理時(shí)間為12 h。檢測(cè)Control、PEG 8000、un-PEG 8000三種條件下谷子葉片H2S含量。白菜、番茄和擬南芥Col-0幼苗分別按上述進(jìn)行處理后檢測(cè)葉片H2S含量，PEG 8000的處理時(shí)間為24 h。

谷子、白菜、番茄和擬南芥Col-0幼苗分為A、B兩組，每組含四種植物。分別置于7 L的玻璃缸內(nèi)。A組缸內(nèi)植株不進(jìn)行脅迫處理(Control)；B組缸內(nèi)的部分谷子幼苗進(jìn)行40% PEG 8000處理12 h；檢測(cè)A組和B組缸內(nèi)非脅迫處理的(un-PEG)谷子、白菜、番茄和擬南芥Col-0幼苗葉片H2S含量。檢測(cè)A組缸內(nèi)谷子、白菜和擬南芥Col-0和B組缸內(nèi)非脅迫處理(un-PEG)的谷子、白菜和擬南芥Col-0幼苗葉片中H2S響應(yīng)基因的表達(dá)變化。

1.5 基因表達(dá)檢測(cè)

提取植株葉片總RNA，按abm公司試劑盒(Cat.No.G492)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以各植物的Actin基因作為內(nèi)參，利用qRT-PCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平變化，結(jié)果以2-δδCt計(jì)算，所用引物見表1。

1.6 氣孔觀察

擬南芥野生型Col-0和突變體lcd/des1分成三組：對(duì)照組、PEG 8000處理的Col-0及處于同一玻璃缸內(nèi)的不處理Col-0和lcd/des1、PEG 8000處理的lcd/des1及處于同一玻璃缸內(nèi)的不處理Col-0和lcd/des1。PEG 8000處理12 h，顯微鏡觀察和記錄玻璃缸內(nèi)葉片氣孔孔徑。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS Statistics軟件對(duì)3次生物學(xué)重復(fù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PEG 8000處理植物提高周圍環(huán)境空氣中H2S含量

可自由通過細(xì)胞膜是氣體信號(hào)分子的特征之一。生理濃度的外源H2S處理提高植物對(duì)干旱、鹽等逆境脅迫的抗性[25～26]，即外源的H2S氣體可以進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮其生理功能。H2S氣體信號(hào)分子參與植物對(duì)多種非生物脅迫的響應(yīng)，即脅迫引起植物內(nèi)源H2S含量升高，那么細(xì)胞內(nèi)的H2S是否會(huì)向空氣中釋放？40% PEG 8000處理擬南芥，谷子，白菜和番茄植株，每12 h檢測(cè)空氣中H2S濃度，結(jié)果表明：脅迫處理谷子12、36 h，處理白菜24、36 h，處理番茄24、36、48 h，處理擬南芥Col-0野生型12、24、36 h后，都檢測(cè)到空氣中的H2S含量升高(圖1A)；而擬南芥內(nèi)源H2S產(chǎn)生酶基因突變體lcd/des1在40% PEG 8000處理后，沒有引起空氣中H2S濃度升高(圖1A)。脅迫引起空氣中H2S濃度升高，因此對(duì)鄰近的非脅迫植株的內(nèi)源H2S含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：受脅迫植株(圖1B，PEG)和處于同一個(gè)玻璃缸中的非脅迫植株葉片的H2S含量(Fig.1B，un-PEG)都高于對(duì)照(圖1B，CK)，即受脅迫植株釋放的H2S可引起鄰近的同物種植株內(nèi)源H2S含量升高。

表1 qRT-PCR所用的引物列表

圖1 PEG 8000處理植物對(duì)空氣中H2S濃度和鄰近非脅迫植株內(nèi)源H2S含量的影響 A.縱坐標(biāo)表示空氣中H2S濃度，橫坐標(biāo)表示PEG 8000處理時(shí)間；B.縱坐標(biāo)表示植物葉片內(nèi)源H2S含量(CK.未處理植株；PEG. 40% PEG 8000處理12 h；un-PEG.與PEG 8000處理植株處于同一玻璃缸內(nèi)的未處理植株) *表示在P<0.05水平存在顯著性差異，Duncan test(下同)。Fig.1 Effect of PEG 8000 on the concentration of H2S in air and endogenous H2S content in nearby un-treated plantA.The ordinate indicates the H2S concentration in the air,and the abscissa indicates the PEG 8000 treatment time; B.The ordinate indicates the endogenous H2S content of the plant leaves(CK. Untreated plants; PEG. 40% PEG 8000 for 12 h; un-PEG. Untreated plants in the same glass jar as the PEG 8000 treated plants) *indicates a significant difference at the P< 0.05 level,Duncan test(the same as below).

圖2 PEG 8000處理谷子對(duì)鄰近非脅迫植物內(nèi)源H2S含量和基因表達(dá)的影響 A.縱坐標(biāo)表示植物葉片H2S含量；B.縱坐標(biāo)表示H2S響應(yīng)基因的相對(duì)表達(dá)量；Control.與未處理谷子處于同一玻璃缸內(nèi)的未處理植株；un-PEG.與PEG 8000處理谷子處于同一玻璃缸內(nèi)的未處理植株Fig.2 PEG 8000 treated foxtail millet effects H2S content and gene expression of adjacent non-stressed plants A. The ordinate indicates the H2S content of the plant leaves; B. The ordinate indicates the relative expression of the H2S response gene Control. The untreated plants in the same glass jar as the untreated millet; un-PEG. The untreated plants in the same glass jar as the PEG 8000 treated millet

圖3 PEG 8000處理擬南芥對(duì)鄰近非脅迫植物基因表達(dá)的影響 A. PEG 8000處理擬南芥Col-0 12 h，同一玻璃缸內(nèi)非脅迫植物H2S響應(yīng)基因相對(duì)表達(dá)變化；B. PEG 8000處理擬南芥lcd/des1 12 h，同一玻璃缸內(nèi)非脅迫植物H2S響應(yīng)基因相對(duì)表達(dá)變化；C. PEG 8000處理擬南芥Col-0 12 h，同一玻璃缸內(nèi)非脅迫植物H2S生成酶基因相對(duì)表達(dá)變化；D. PEG 8000處理擬南芥lcd/des1 12 h，同一玻璃缸內(nèi)非脅迫植物H2S生成酶基因相對(duì)表達(dá)變化Fig.3 The effect of PEG 8000 treated Arabidopsis on gene expression of adjacent non-stressed plants A. PEG 8000 treatment of Arabidopsis Col-0 12 h, relative expression of H2S response genes in non-stressed plants in the same glass jar; B. PEG 8000 treatment of Arabidopsis lcd/des1 12 h, H2S response gene in non-stress plants in the same glass jar Relative expression changes; C. PEG 8000 treatment of Arabidopsis Col-0 12 h, relative expression of LCD and DES in non-stressed plants in the same glass jar; D. PEG 8000 treatment of Arabidopsis lcd/des1 12 h, relative expression of LCD and DES in non-stressed plants in the same glass jar

2.2 PEG 8000處理谷子對(duì)鄰近其它非脅迫植物的H2S含量和基因表達(dá)的影響

谷子幼苗經(jīng)PEG 8000處理12 h，檢測(cè)同一玻璃缸內(nèi)未處理的谷子、擬南芥(Col-0)、番茄和白菜葉片的H2S含量和H2S響應(yīng)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，與未經(jīng)PEG 8000處理谷子缸內(nèi)的谷子、擬南芥(Col-0)、番茄和白菜相比(圖2A，Control)，經(jīng)40% PEG 8000處理12 h谷子缸內(nèi)的非PEG 8000處理的谷子、擬南芥(Col-0)、番茄和白菜葉片的H2S含量升高(圖2A，un-PEG)。H2S信號(hào)分子可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)參與植物對(duì)脅迫的響應(yīng)，選取已經(jīng)報(bào)道響應(yīng)H2S的谷子CBL，CaM[27]，擬南芥MPK4，SAT1，RD29A，SAT5[28～29]和白菜FNR1，F(xiàn)C1，LHCB4.3[30]基因進(jìn)行檢測(cè)(圖2B)，與放置在未經(jīng)PEG 8000處理谷子相同缸內(nèi)的植物相比(圖B，Control)，放置在40% PEG 8000處理谷子同一玻璃缸內(nèi)的非處理的谷子、擬南芥(Col-0)和白菜葉片的上述基因表達(dá)都升高(圖2B，un-PEG)。

圖4 PEG 8000處理擬南芥對(duì)鄰近非脅迫擬南芥氣孔運(yùn)動(dòng)的影響 A.縱坐標(biāo)表示氣孔孔徑(PEG-8000. 40% PEG 8000處理12 h植株；ut-Jar(Col-0).與PEG 8000處理的Col-0處于同一玻璃缸內(nèi)的未處理植株；ut-Jar(lcd/des1).與PEG 8000處理的lcd/des1處于同一玻璃缸內(nèi)的未處理植株 不同字母表示顯著性差異，Duncan test，P<0.05)；B.氣孔顯微鏡觀察Fig.4 The effect of PEG 8000 treated Arabidopsis on stomatal aperture of adjacent non-stressed Arabidopsis A. Ordinate indicates stomatal aperture(PEG-8000. 40% PEG 8000 treated 12 h plant; ut-Jar(Col-0). Untreated plant in the same glass jar as PEG 8000 treated Col-0; ut-Jar(lcd/des1). Untreated plants in the same glass jar as PEG 8000 treated lcd/des1 With different letters indicating significant differences,Duncan test,P<0.05); B.Observation by a stomatal microscope

2.3 PEG 8000處理擬南芥對(duì)鄰近非脅迫植物基因表達(dá)和氣孔運(yùn)動(dòng)的影響

PEG 8000處理谷子引起鄰近植物的內(nèi)源H2S含量和H2S響應(yīng)基因表達(dá)變化，利用擬南芥野生型Col-0和H2S產(chǎn)生酶基因LCD和DES1雙突變體lcd/des1對(duì)該結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。PEG 8000處理Col-0和突變體lcd/des1植株12 h后，檢測(cè)未處理植物的基因表達(dá)變化(圖3A)，處于Col-0玻璃缸內(nèi)的未處理白菜，擬南芥(Col-0)和谷子中受H2S調(diào)控的基因均顯著升高(圖3A)，而處于擬南芥lcd/des1相同玻璃缸內(nèi)的未處理植株基因表達(dá)變化并不明顯(圖3B)。為了了解鄰近植物內(nèi)源H2S含量升高的原因，檢測(cè)其主要的H2S產(chǎn)生酶基因LCD、DES的表達(dá)變化。結(jié)果表明，放置在PEG 8000處理的擬南芥Col-0或lcd/des1玻璃缸內(nèi)的未處理植物的LCD、DES基因表達(dá)均無顯著性變化(圖3C,D)。

H2S信號(hào)分子促進(jìn)氣孔關(guān)閉，參與植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)[25]，對(duì)上述處理?xiàng)l件下的擬南芥Col-0和lcd/des1氣孔孔徑進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，PEG 8000處理12 h的Col-0氣孔孔徑明顯小于對(duì)照Col-0，也可導(dǎo)致同一玻璃缸內(nèi)未處理的Col-0和lcd/des1氣孔孔徑減??；PEG 8000處理12 h的lcd/des1氣孔孔徑小于對(duì)照lcd/des1，但不能使同一玻璃缸內(nèi)未處理的Col-0和lcd/des1氣孔孔徑減小(圖4)。

3 討論

植物個(gè)體間通過揮發(fā)性物質(zhì)傳遞信息。1983年，Baldwin等報(bào)道葉片的機(jī)械損傷可導(dǎo)致附近的未受損樹木的酚類和單寧等升高[31]。Dudareva等將已發(fā)現(xiàn)的植物揮發(fā)性物質(zhì)分為四類：萜類化合物、脂肪酸衍生物、苯環(huán)及苯丙烷衍生物和氨基酸衍生物[32]，這些物質(zhì)多數(shù)屬于次級(jí)代謝物，可作為信號(hào)分子、抗氧化劑等發(fā)揮多種生理或生態(tài)功能。除了植物，這些揮發(fā)性物質(zhì)在動(dòng)物，細(xì)菌及真菌中同樣存在。近十幾年來，NO、CO和H2S等氣體信號(hào)分子的相關(guān)研究大量報(bào)道，集中于這些分子在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)，外源供體處理提高細(xì)胞或個(gè)體對(duì)脅迫的抵抗等機(jī)制研究。植物體細(xì)胞內(nèi)的H2S主要由酶催化產(chǎn)生，可被低溫、干旱等脅迫誘導(dǎo)升高，參與后續(xù)的脅迫抵抗和耐受反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，PEG 8000脅迫可引起植物向周圍環(huán)境中釋放H2S，使鄰近非脅迫植株的內(nèi)源H2S含量升高(圖1)，通過對(duì)鄰近植株中H2S合成酶基因表達(dá)變化的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些植物中的H2S合成酶基因表達(dá)沒有顯著變化，所以鄰近植株內(nèi)源H2S含量升高是由于吸收空氣中的H2S導(dǎo)致，并不是H2S合成酶基因被誘導(dǎo)表達(dá)。受脅迫植物釋放的H2S還調(diào)節(jié)鄰近植株的H2S響應(yīng)基因表達(dá)(圖2～3)和氣孔運(yùn)動(dòng)(圖4)，即H2S不僅可以作為細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子發(fā)揮生理調(diào)節(jié)作用，還可以作為植物不同個(gè)體間的信息傳遞分子，參與整個(gè)植物群體對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)，為植物“語言”的組成添加了新的“成員”。在本研究的實(shí)驗(yàn)體系中，所使用的玻璃缸容積為7L，檢測(cè)到受脅迫植物所在的環(huán)境H2S濃度升高，并且對(duì)鄰近植株產(chǎn)生影響，但是在自然條件下，受脅迫植株釋放到環(huán)境中的H2S的量，及H2S的有效作用范圍和作用持續(xù)時(shí)間難以檢測(cè)，這也是其它種類的綠葉揮發(fā)物需要進(jìn)一步研究的內(nèi)容。大部分創(chuàng)傷誘導(dǎo)揮發(fā)物或綠葉揮發(fā)物需要通過氣孔進(jìn)入鄰近植物，而H2S氣體信號(hào)分子不只通過氣孔進(jìn)入植物細(xì)胞。此外，茉莉酸甲脂[33]，水楊酸[34]等需要經(jīng)特定的受體激活信號(hào)途徑，但H2S無特定的受體分子，目前研究發(fā)現(xiàn)H2S可以對(duì)多種蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾(S-sulfhydration)，對(duì)蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)[35～36]。

動(dòng)物個(gè)體間通過聲音、行為、氣味等方式傳遞信息，動(dòng)物個(gè)體可以通過不同的音節(jié)組成不同的信息。那植物是否會(huì)通過釋放不同的揮發(fā)物組合來達(dá)到類似于動(dòng)物個(gè)體信息傳遞中不同音節(jié)的效果，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同脅迫的預(yù)警機(jī)制？或者通過不同揮發(fā)物組合達(dá)到迅速或緩慢傳遞信息的目的？總之，這種植株間的信號(hào)交流是植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成的一種保護(hù)機(jī)制，對(duì)植物個(gè)體或群體的生存和繁衍都具有重要的意義。

4 結(jié)論

從本文的研究結(jié)果看來，H2S作為一個(gè)氣體信號(hào)分子，它不僅可以增強(qiáng)植物自身對(duì)于逆境脅迫的抵抗力，還可以作為植株間信息交流的信號(hào)分子，向鄰近的健康植株傳遞脅迫預(yù)警信號(hào)，使它們提前調(diào)整自身的新陳代謝，以應(yīng)對(duì)可能即將來臨的危險(xiǎn)，這種植物進(jìn)化出來的保護(hù)機(jī)制對(duì)植物種群的生存起到至關(guān)重要的作用。